B细胞靶向的平行CAR(pCAR)治疗剂制造技术

本文提供了一种表达B细胞靶向的pCAR的免疫应答细胞，pCAR包括第二代嵌合抗原受体(CAR)和嵌合共刺激受体(CCR)。本文还提供了制备该免疫应答细胞的方法和用该免疫应答性细胞引导T细胞介导的免疫应答的方法。胞引导T细胞介导的免疫应答的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】B细胞靶向的平行CAR(pCAR)治疗剂

技术介绍

[0001]嵌合抗原受体(CAR)，有时被称为人工T细胞受体、嵌合T细胞受体(cTCR)或嵌合免疫受体，是目前本领域中众所周知的工程受体。它们主要用于改造免疫效应细胞，特别是T细胞，以使这些细胞具有所需的工程特异性。在癌症治疗领域，使用CAR
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T细胞的适应性细胞疗法尤其被聚焦研究。在这些疗法中，从患者身上取出T细胞，并对其进行改造，使其表达特异性识别特定癌症形式中发现的抗原的CAR。然后将能识别并杀死癌细胞的这些CAR
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T细胞重新导回病人体内。
[0002]第一代CAR提供TCR样的信号，最常见的是使用CD3 zeta(z)胞内信号域，从而引发杀伤肿瘤的功能。然而，如果缺乏伴随的共刺激信号，CD3z链融合受体的参与可能不足以引起大量IL
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2的分泌和/或T细胞增殖。在生理性T细胞反应中，最佳的淋巴细胞激活需要一个或多个共刺激受体如CD28或4
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1BB的参与。
[0003]第二代CAR已被构建为除了抗原依赖的TCR样信号外，还可在人类原代T细胞中转导功能性抗原依赖的共刺激信号，这样除了允许T细胞增殖，还可保障杀瘤活性。第二代CAR最常见的是利用来自CD28或4
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1BB的共刺激域(亦称共刺激信号区)提供共刺激。共刺激加上CD3 zeta信号的联合传递使第二代CAR在功能上明显优于第一代的同类产品(仅有CD3z信号)。第二代CAR的一个示例可参见美国专利号7,446,190，在此通过引用并入本文。
[0004]最近，所谓的第三代CAR已被制备。它们将多个共刺激域(亦称共刺激信号区)和顺式的TCR样信号域相结合，如CD28+4
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1BB+CD3z或CD28+OX40+CD3z，以进一步增强效力。在所述第三代CAR中，这些共刺激结构域在CAR内域(endodomain)中串联排列，且通常位于CD3z或其等同物的上游。
[0005]然而总的来说，这些第三代CAR取得的结果令人失望，与第二代的构型相比仅略有改善，一些第三代CAR甚至不如于第二代构型。
[0006]我们最近描述了一种新的形式，其中免疫应答细胞如T细胞被工程化以平行表达两种构建体，即第二代CAR和嵌合共刺激受体(co
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istimulatory receptor，CCR)。所述第二代CAR从C端到N端(从细胞内到细胞外)，包括以下结构域：(a)信号区；(b)共刺激信号区；(c)跨膜结构域；和(d)与第一靶抗原上的第一表位特异性相互作用的第一结合元件。CCR从C端到N端(从细胞内到细胞外)包括：(a)与CAR的共刺激信号区不同的共刺激信号区；(b)跨膜结构域；和(c)与靶抗原上的表位特异性相互作用的第二结合元件。所述CAR和CCR可识别相同的表位、同一抗原上的不同表位或两种不同抗原上的表位。与所述CAR不同，所述CCR缺乏TCR样信号区，如CD3z。与第一代CAR
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T细胞、第二代CAR
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T细胞和第三代CAR
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T细胞相比，这些平行CAR(parallel CAR，pCAR)工程化T细胞表现出卓越的活性和抗衰竭能力。见美国预授权专利，公开号2019/0002521，在此通过引用将其全文并入本文。
[0007]pCAR
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T细胞的这些特性使其成为治疗难治性恶性肿瘤的有吸引力的候选者，其中第一代、第二代和第三代CAR
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T细胞由于T细胞衰竭而显示出有限的疗效。然而，还需要有抗原靶点组合，使这种技术的治疗应用更加广泛。
[0008]专利技术简述
[0009]申请人已经发现，使用构建体的组合可以诱导有效的T细胞应答，其中多个共刺激区被安排在不同的构建体中。具体地，本文提供了具有平行CAR(parallel CAR，pCAR)构建体的有效的pCAR
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T细胞，所述构建体与源自B细胞系的靶细胞上存在的一个或多个抗原结合。在一些实施方案中，所述pCAR构建体包括CAR(嵌合抗原受体)，所述CAR包含特异性结合靶细胞上发现的CD19表位的结合元件；和结合CD19或另一个B细胞系的特性标志物的CCR(chimeric costimulatory receptor，嵌合共刺激受体)。后者的示例包括但不限于CD20、CD22、CD23、CD79a和CD79b。
[0010]因此，根据一些实施方案，本文提供一种免疫应答细胞，其表达：
[0011]i.第二代嵌合抗原受体(CAR)，所述第二代抗原嵌合受体包括：
[0012]a)信号区；
[0013]b)第一共刺激信号区；
[0014]c)第一跨膜结构域；和
[0015]d)与CD19靶抗原上的表位特异性相互作用的第一结合元件；以及
[0016]ii.嵌合共刺激受体(CCR)，所述嵌合共刺激受体包括：
[0017]e)第二共刺激信号区，其中所述第二共刺激信号区不同于所述第一共刺激信号区；
[0018]f)第二跨膜结构域；和
[0019]g)与第二靶抗原上的第二表位特异性地相互作用的第二结合元件，其中所述第二靶抗原为CD19或另一个B细胞相关的靶抗原。
[0020]当表达靶向B细胞pCAR构建体的T细胞结合表达一种或多种抗原(其具有两种表位靶点(对于CAR和CCR))的细胞时，CAR和CCR均发出刺激信号以增强T细胞的应答。
[0021]本专利技术类型的构建体可称为“平行嵌合激活受体(parallel chimeric activating receptor)”或“pCAR”。申请人已发现本文所述的pCAR在体外和体内实验中均优于具有相似元件的第二代CAR
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T细胞。
[0022]此外，在用表达抗原的肿瘤细胞进行多轮反复的刺激中，T细胞的增殖、其保持细胞毒性效力的能力和释放IL
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2的能力得以保持。
[0023]在一些实施方案中，由pCAR的CAR组分识别的第一表位是CD19靶抗原上的表位。在一些实施方案中，所述第一结合元件包括FMC63抗体的互补决定区(CDR)，所述互补决定区具有SEQ ID NO:10、11、12、13、14和15所示序列。在一些实施方案中，所述第一结合元件包括FMC63抗体的可变重域(V
H
；GenBank登录号CAA74659.1)和可变轻域(V
L
；GenBank登录号CAA74660.1)，所述可变重域和可变轻域具有SEQ ID NO:16和17所示序列。在一些实施方案中，所述第一结合元件包括FMC63单链可变片段(scFv)，所述单链可变片段(scFv)包括FMC63抗体的可变重域(V
H
)和可变轻域(V
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)，所述可变重域和可变轻域具有SEQ ID NO:18或19所示序列。在一些实施方案中，FMC63 sc本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种免疫应答细胞，其表达：i.第二代嵌合抗原受体(CAR)，所述第二代嵌合抗原受体包括：a)信号区；b)第一共刺激信号区；c)第一跨膜结构域；和d)与CD19靶抗原上的第一表位特异性相互作用的第一结合元件；以及ii.嵌合共刺激受体(CCR)，所述嵌合共刺激受体包括：e)第二共刺激信号区，其中所述第二共刺激信号区不同于所述第一共刺激信号区；f)第二跨膜结构域；和g)与第二靶抗原上的第二表位特异性相互作用的第二结合元件，其中所述第二靶抗原为CD19或另一个B细胞系特异性靶抗原。2.如权利要求1所述的免疫应答细胞，其中所述第一结合元件包括：CDR1 V
H
，所述CDR1 V
H
包含SEQ ID NO:10所示序列，CDR2 V
H
，所述CDR2 V
H
包含SEQ ID NO:11所示序列，CDR3 V
H
，所述CDR3 V
H
包含选自SEQ ID NO:20
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26所示的序列中的一个，CDR1 V
L
，所述CDR1 V
L
包含SEQ ID NO:13所示序列，CDR2 V
L
，所述CDR2 V
L
包含SEQ ID NO:14所示序列，和CDR3 V
L
，所述CDR3 V
L
包含SEQ ID NO:15所示序列。3.如权利要求2所述的免疫应答细胞，其中所述第一结合元件包括：V
H
，所述V
H
包含SEQ ID NO:16所示序列的变体，其中所述变体在SEQ ID NO:16的CDR3V
H
区有G到A或Y到A的单氨基酸突变，以包含选自SEQ ID NOs:20
‑
26所示序列中的一个，和V
L
，所述V
L
包含SEQ ID NO:17所示序列。4.如权利要求2或3所述的免疫应答细胞，其中所述第一结合元件包括单链可变片段(scFv)，所述单链可变片段包含选自SEQ ID NO:18
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19所示序列中的一个的变体，其中所述变体在CDR3 V
H
区有G到A或Y到A的单氨基酸突变，以包含选自SEQ ID NO:20
‑
26所示序列中的一个。5.如权利要求1所述的免疫应答细胞，其中所述第一结合元件包括：CDR1 V
H
，所述CDR1 V
H
包含SEQ ID NO:10所示的序列，CDR2 V
H
，所述CDR2 V
H
包含SEQ ID NO:11所示的序列，CDR3 V
H
，所述CDR3 V
H
包含SEQ ID NO:12所示的序列，CDR1 V
L
，所述CDR1 V
L
包含SEQ ID NO:13所示的序列，CDR2 V
L
，所述CDR2 V
L
包含SEQ ID NO:14所示的序列，和CDR3 V
L
，所述CDR3 V
L
包含SEQ ID NO:15所示的序列。6.如权利要求5所述的免疫应答细胞，其中所述第一结合元件包括具有SEQ ID NO:16所示序列的V
H
区和具有SEQ ID NO:17所示序列的V
L
区。7.如权利要求5或6所述的免疫应答细胞，其中所述第一结合元件包括具有SEQ ID NO:18或19所示序列的单链可变片段(scFv)。8.如前述权利要求中任一项所述的免疫应答细胞，其中包含所述第二表位的所述第二靶抗原为选自由CD19、CD20、CD22、CD23、CD79a和CD79b组成的组中的B细胞系特异性抗原。
9.如前述权利要求中任一项所述的免疫应答细胞，其中所述第二结合元件包括：CDR1 V
H
，所述CDR1 V
H
包含SEQ ID NO:10所示的序列，CDR2 V
H
，所述CDR2 V
H
包含SEQ ID NO:11所示的序列，CDR3 V
H
，所述CDR3 V
H
包含SEQ ID NO:12所示的序列，CDR1 V
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，所述CDR1 V
L
包含SEQ ID NO:13所示的序列，CDR2 V
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，所述CDR2 V
L
包含SEQ ID NO:14所示的序列，和CDR3 V
L
，所述CDR3 V
L
包含SEQ ID NO:15所示的序列。10.如权利要求9所述的免疫应答细胞，其中所述第二结合元件包含具有SEQ ID NO:16所示序列的V
H
区和具有SEQ ID NO:17所示序列的V
L
区。11.如权利要求9或10所述的免疫应答细胞，其中所述第二结合元件包括具有SEQ ID NO:18或19所示序列的单链可变片段(scFv)。12.如权利要求1至8中任一项所述的免疫应答细胞，其中所述第二结合元件包括：CDR1 V
H
，所述CDR1 V
H
包含SEQ ID NO:27所示的序列，CDR2 V
H
，所述CDR2 V
H
包含SEQ ID NO:28所示的序列，CDR3 V
H
，所述CDR3 V
H
包含SEQ ID NO:29所示的序列，CDR1 V
L
，所述CDR1 V
L
包含SEQ ID NO:30所示的...

【专利技术属性】
技术研发人员：J，
申请(专利权)人：伦敦国王学院，
类型：发明
国别省市：