一种检测血清中晚期糖基化终末产物的试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术涉及晚期糖基化终末产物检测技术领域，尤其涉及一种检测血清中晚期糖基化终末产物的试剂盒及其应用。本发明专利技术检测血清中游离晚期糖基化终末产物的试剂盒包括洗脱液、稀释液、蛋白沉淀剂、质控品；所述蛋白沉淀剂为磺基水杨酸；本发明专利技术同时提供了一种检测血清样本中游离晚期糖基化终末产物的方法。采用本发明专利技术的检测方法及试剂盒，样品前处理更加简单、方便，仅需要一步蛋白沉淀过程，就能有效提取样本中的24种游离AGEs，同时可实现“一针进样”同时检测24种游离AGEs，单个样本检测时长为6分钟，大大缩短样本时间，通过色谱条件优化，能将生物体内存在的AGEs同分异构体实现基线分离，提高了定量的特异性和准确性。了定量的特异性和准确性。了定量的特异性和准确性。

【技术实现步骤摘要】
一种检测血清中晚期糖基化终末产物的试剂盒及其应用


[0001]本专利技术涉及晚期糖基化终末产物检测
，尤其涉及一种检测血清中晚期糖基化终末产物的试剂盒及其应用。

技术介绍

[0002]晚期糖基化终末产物(advanced glycation end products，AGEs)是体内蛋白质、脂质或核酸类大分子暴露于还原糖中生成的一组复杂的异质性物质，是人体在非酶促条件下，体内葡萄糖或其他还原糖的醛基或酮基与蛋白质、核酸、脂质等一些大分子物质的自由氨基，在体内经过系列反应生成的不可逆终末产物。AGEs对酶稳定，不易被降解，主要通过肾脏清除，在体内随着糖尿病、衰老等发展过程不断生成和蓄积，直接或间接与细胞表面的受体结合而发挥细胞毒性作用。多种研究表明体内血清中游离AGEs的含量在某些代谢性疾病如糖尿病及其并发症，心脑血管疾病如动脉粥样硬化及阿尔茨海默症等疾病中呈现不同程度的升高，是这类疾病的预警、诊断及疗效监测标志物。因此对不同疾病状态下各种不同结构的AGEs进行精准定量，为开发疾病的早期诊断标志物及疗效检测指标具有重要意义。
[0003]血清内游离AGEs是一类氨基酸衍生型的小分子物质，根据其与氨基酸结合类型的不同可大致分为赖氨酸衍生型、精氨酸衍生型、赖氨酸
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精氨酸交联衍生型、半胱氨酸衍生型及组氨酸衍生型等。游离型AGEs在血液中含量低(通常在pmol水平)、结构类似物众多，因此，对检测方法的灵敏度和特异性要求很高。目前AGEs的常用检测方法包括荧光光谱法、酶联免疫吸附试验(ELISA)、高效液相色谱法(HPLC)、免疫荧光法(FIA)、免疫组织化学法和放射免疫分析法(RIA)、液相色谱串联质谱法(LC
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MS/MS)等。荧光光谱法在临床应用较多，但是存在只能检测到具有荧光发光基团的少数几种AGEs的缺点。ELISA法是基于抗原抗体特异性结合的检测方法。然而由于一些AGEs有相同的抗原决定簇，其抗原表位发生改变会导致检测结果假性降低，另一方面AGEs可能会与非AGEs修饰的结构发生交叉反应导致结果假性升高，同时不含该抗原表位的蛋白来源AGEs和脂类来源的AGEs不能检测。RIA存在放射性核素对人体损害较大并造成环境污染。以抗原
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抗体免疫反应为基础的方法，不可避免的带来了非特异性反应的问题而使得测定结果有明显系统误差，同时各实验室使用不同生产厂家的试剂导致结果可比性差，直接影响了检测结果在疾病筛查中的可信度。HPLC法能对AGEs中特定的几种能发荧光或者紫外光的化合物进行检测，对结构及其相似的化合物不能做到全部分离，从而干扰方法的特异性。
[0004]随着质谱技术的快速发展，液相色谱串联质谱法(LC
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MS/MS)由于结合了质谱的高分辨与液相的高分离特点，对于小分子化合物的定量有着独特的优势。然而由于AGEs这类物质具有种类繁多、结构复杂、商品化的纯度标准品难以获得、化合物极性大色谱分离困难且存在多种同分异构体，关于多种血清游离AGEs同步检测的LC
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MS/MS方法还未见报道。同时目前缺乏相应的质谱检测试剂盒应用于临床检测，限制了其在临床上的应用。因此，开发稳定的基于LC
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MS/MS技术的检测血清游离AGEs的方法，并研制相应的检测试剂盒能够为临床提供更加准确可靠的检测方法，对推广精准医疗，提高国内代谢性相关疾病的诊断治疗
水平具有重要意义。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种检测血清中晚期糖基化终末产物的试剂盒及其应用。本专利技术采用同步检测血清中24种游离AGEs的LC
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MS/MS方法检测血清中游离AGEs，具有简单、耗时显著缩短、精准定量的优点。
[0006]为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：提供一种检测血清中游离晚期糖基化终末产物的试剂盒，所述试剂盒包括洗脱液、稀释液、蛋白沉淀剂、质控品；
[0007]所述蛋白沉淀剂为磺基水杨酸；
[0008]所述晚期糖基化终末产物包括：N
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(羧甲基)
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赖氨酸CML、N
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(1
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羧乙基)赖氨酸CEL、N6‑
甲酰基赖氨酸Formyl Lysine、N6‑
乙酰基赖氨酸Acetyl Lysine、N6‑
丙酰基赖氨酸lactoyl Lysine、N6‑
草酰基赖氨酸Oxalyl Lysine、N6‑
丙三醇基赖氨酸glycerinyl Lysine、N
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(2
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羟乙酰基)赖氨酸GALA、吡咯素Pyrraline、N
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(羧甲基)
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精氨酸CMA、N
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(羧乙基)精氨酸CEA、N
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(二甲基嘧啶)精氨酸Argpyrimidine、咪唑啉酮精氨酸G
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H、甲基咪唑啉酮精氨酸MG
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H、3
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脱氧葡萄糖酮3DG
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H、四氢嘧啶THP、乙二醛
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赖氨酸二聚体GOLD、甲基乙二醛
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赖氨酸二聚体MOLD、3
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脱氧葡萄糖苷
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赖氨酸二聚体DOLD、N6‑
乙二醛基赖氨酸二聚体GOLA、乙二醛赖氨酸
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精氨酸二聚体GODIC、甲基乙二醛赖氨酸
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精氨酸二聚体MODIC、戊糖苷素PEN、羧甲基半胱氨酸CMC中的一种或多种。
[0009]作为本专利技术所述试剂盒的优选实施方式，所述蛋白沉淀剂与血清样本的体积比为(1:4)～(1:1)。
[0010]作为本专利技术所述试剂盒的优选实施方式，所述洗脱液包括洗脱液A和洗脱液B；所述洗脱液A为九氟戊酸水溶液，所述洗脱液B为质谱纯乙腈。优选地，所述九氟戊酸水溶液中九氟戊酸的浓度为20mmol/L。
[0011]作为本专利技术所述试剂盒的优选实施方式，所述稀释液为空白血清基质，所述质控品为以所述稀释液作溶剂的溶液。
[0012]作为本专利技术所述试剂盒的优选实施方式，所述质控品包括4种，其中溶质分别是：浓度为1、50、100和500ng/mL的所述晚期糖基化终末产物。
[0013]作为本专利技术所述试剂盒的优选实施方式，所述试剂盒还包括复溶液、标准品和内标液；
[0014]所述复溶液为甲酸：水溶液；所述复溶液中甲酸与水的体积比为甲酸：水＝1：99；
[0015]所述标准品为所述晚期糖基化终末产物与所述复溶液的混合溶液，混合标准品的浓度分别为1、5、10、50、125、250和500ng/mL；
[0016]所述内标液为晚期糖基化终末产物内标溶液与所述复溶液的混合溶液，所述晚期糖基化终末产物内标溶液为超纯水配制的CML
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d4、GOLD
‑
15
N2、G
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
Premier BEH C18 AX，1.7um，100
×
2.1mm色谱柱。9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)还包括在进行血清样本前处理前加入内标化合物，所述内标化合物选自CML
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d4、GOLD
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15
N2、G
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H1
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13
C2、MG
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H1
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d3和Pentosidine
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d3中的一种或多种。10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中多反应监测技术检测所述游离晚期糖基化终末产物及内标的参数如下：MG
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H离子对，m/z:229
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70，去簇电压为40V、碰撞电压为30V、碰撞池入口电压为10V、碰撞池出口电压为12V；G
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H离子对，m/z:215
‑
70，去簇电压为30V、碰撞电压为20V、碰撞池入口电压为10V、碰撞池出口电压为10V；CEL离子对，m/z:219
‑
84，去簇电压为40V、碰撞电压为20V、碰撞池入口电压为9V、碰撞池出口电压为12V；CML离子对，m/z:205
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84，去簇电压为40V、碰撞电压为15V、碰撞池入口电压为8V、碰撞池出口电压为11V；CEA离子对，m/z:247
‑
70，去簇电压为20V、碰撞电压为30V、碰撞池入口电压为8V、碰撞池出口电压为12V；CMA离子对，m/z:233
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70，去簇电压为20V、碰撞电压为20V、碰撞池入口电压为8V、碰撞池出口电压为7V；GALA离子对，m/z:205
‑
84，去簇电压为40V、碰撞电压为25V、碰撞池入口电压为8V、碰撞池出口电压为12V；Pyrraline离子对，m/z:255
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175，去簇电压为20V、碰撞电压为12V、碰撞池入口电压为3V、碰撞池出口电压为16V；Argpyrimidine离子对，m/z:255
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70，去簇电压为40V、碰撞电压为20V、碰撞池入口电压为4V、碰撞池出口电压为15V；GOLD离子对，m/z:327
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84，去簇电压为40V、碰撞电压为30V、碰撞池入口电压为10V、碰撞池出口电压为12V；MOLD离子对，m/z:341
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84，去簇电压为60V、碰撞电压为30V、碰撞池入口电压为11V、碰撞池出口电压为14V；GODIC离子对，m/z:343
‑
183，去簇电压为40V、碰撞电压为30V、碰撞池入口电压为7V、碰撞池出口电压为13V；Pentosidine离子对，m/z:379
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135，去簇电压为40V、碰撞电压为40V、碰撞池入口电压为8V、碰撞池出口电压为16V；CMC离子对，m/z:180
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163，去簇电压为20V、碰撞电压为10V、碰撞池入口电压为10V...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄宪章，严君，徐玉竹，张乔轩，韩丽乔，展敏，张鹏伟，万泽民，王建兵，柯培锋，庄俊华，
申请(专利权)人：广东省中医院广州中医药大学第二附属医院，广州中医药大学第二临床医学院，广东省中医药科学院，
类型：发明
国别省市：