一种薏苡仁中呕吐毒素酶联免疫检测试剂盒和方法技术

本发明专利技术涉及本发明专利技术涉及食品毒素残留检测技术，特别是一种薏苡仁中呕吐毒素的酶联免疫检测试剂盒和方法。所述试剂盒包括96孔酶标板，辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体；所述96孔酶标板的反应孔中包被有式I所示的呕吐毒素衍生化半抗原；本发明专利技术建立了薏苡仁中呕吐毒素残留检测的酶联免疫检测法，灵敏度高、特异性好、操作简便、检测成低、一次性检测样本量大等特点，能够更好地满足我国食品企业、政府监管部门等开展检测工作。部门等开展检测工作。

【技术实现步骤摘要】
一种薏苡仁中呕吐毒素酶联免疫检测试剂盒和方法


[0001]本专利技术涉及食品毒素残留检测技术，特别是一种薏苡仁中呕吐毒素的酶联免疫检测试剂盒和方法。

技术介绍

[0002]薏苡仁为药食两用常用大宗药材，具有利水渗湿、健脾止泻的功效。其原植物薏苡为禾本科植物，在生长过程中由于气候原因易受禾谷镰刀菌(F.graminearum)和黄色镰刀菌(F.cuLmorum)等产生呕吐毒素等多种真菌污染，产生呕吐毒素(vomitoxin)，又称脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)，已被国际癌症研究机构(IARC)列为三类致癌物
[2]。
[0003]2020年版《中国药典》2351真菌毒素测定法中呕吐毒素以HPLC和LC
‑
MS检测方法为主
[3]，该方法检测周期长，费时、费力，不能满足药材的快速大批量质量筛查。免疫分析技术是利用抗原、抗体的特异性反应建立的一种快速、灵敏检测方法，具有快速、简便、实时、易于进行现场检测、样品前处理简单、灵敏度高、选择性强、适合于高通量分析等优点。在医学、食品和环境等领域均有应用，其中以酶联免疫分析技术(enzyme
‑
linked immunosorbent assay，ELISA)应用最为广泛
[4]。目前，甘草酸
[5]、青蒿素
[6]、人参皂苷Re
[7]、木犀草苷
[8]、绿原酸
[9](Zhang B等，2018)和葛根素
[10
‑
11]等中药材指标性成分已建立相应的ELISA检测方法，而中药材中真菌毒素ELISA检测相关报道则较少。
[0004]目前，在食品等领域已有诸多呕吐毒素的ELISA检测方法报道
[12
‑
13]，另外食品安全国家标准(GB 5009.111—2016)也已将呕吐毒素的ELISA检测方法进行了收载
[14]。前期实验研究结果发现，薏苡仁等基质复杂的中药材不能照搬采用食品行业国家标准中的前处理方法以及检测试剂，需针对中药材的复杂基质进行前处理和检测方法优化。

技术实现思路

[0005]基于上述领域的需求，本研究通过将呕吐毒素进行化学衍生，获得呕吐毒素
‑
蛋白的完全抗原。利用单克隆抗体制备技术，制备呕吐毒素的单克隆抗体，通过对薏苡仁基质效应的综合考察，建立薏苡仁中呕吐毒素残留的酶联免疫检测方法，从而实现薏苡仁中呕吐毒素的快速批量检测。具体技术方案如下：
[0006]一种人工薏苡仁中呕吐毒素衍生化半抗原，其特征在于，具有式I所示的分子结构
[0007][0008]其核磁共振氢谱参数如下：1H
‑
NMR(CDCl3,300MHz)δ：11.0(s,1H,COOH)，6.54(d,1H,C＝CH)，4.26(d,1H,CH
‑
O
‑
)，4.06(s,1H,
‑
CH
‑
O)，3.58
‑
3.65(s,3H,OH)，2.59
‑
2.71(d,
4H,
‑
CH2‑
)，1.46
‑
1.71(m,2H,
‑
CH
‑
)，1.01(s,3H,
‑
CH3)。
[0009]一种人工薏苡仁中呕吐毒素人工抗原，是通过以下步骤制得：
[0010]合成权利要求1所述的呕吐毒素半抗原合成：将50mg呕吐毒素溶于乙腈中，加入200μL醋酸，搅拌，再加入40mg巯基丙酸，80℃搅拌12h；停止反应，加水，加氢氧化钠水溶液调pH到13，加乙酸乙酯萃取，除去有机相，加盐酸调节pH到6，加乙酸乙酯萃取，有机相蒸干，石油醚洗涤结晶，得到所述的呕吐毒素衍生化半抗原；
[0011]制备呕吐毒素人工抗原：将所述呕吐毒素衍生化半抗原分别与BSA和OVA偶联，作为免疫抗原(DON
‑
BSA)和包被抗原(DON
‑
OVA)。具体制备过程：取11mg呕吐毒素衍生化半抗原溶于1mL DMF中，取30mg DCC和30mg NHS溶于0.2mL水后加入半抗原溶液中，室温搅拌24h，得到溶液Ⅰ；称取50mg载体蛋白溶于3.8mL PBS中，得到溶液Ⅱ；将溶液Ⅰ逐滴缓慢滴加到溶液Ⅱ中，室温搅拌24h；用PBS于4℃透析3d，每天换3次透析液得呕吐毒素人工抗原。
[0012]一种薏苡仁中呕吐毒素的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包含96孔酶标板，辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体；所述96孔酶标板的反应孔中包被有所述的呕吐毒素人工抗原。
[0013]一种薏苡仁中呕吐毒素的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包含辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体，以及所述的呕吐毒素人工抗原。
[0014]所述的试剂盒，其特征在于：还包含PBST洗涤液，封闭液。
[0015]一种检测薏苡仁中呕吐毒素的方法，其特征在于包括以下步骤：
[0016](1)获取标准曲线：以标准品的0μg
·
kg
‑1时的OD
450nm
值为B0值，其他质量浓度的OD
450nm
值为B值，以标准品质量浓度的对数值为横坐标，百分吸光率值(B/B0×
100％)为纵坐标，用OriginPro7.5软件绘制标准曲线；
[0017]各质量浓度的标准品的OD
450nm
测定步骤如下：用包被缓冲液将包被抗原稀释至最佳工作浓度后，包被于96孔酶标板上，100μL每孔，4℃下过夜；倾去板中溶液，用PBST洗涤1次，加入封闭液150μL每孔，37℃温育2h；去掉封闭液后，晾干；加入系列浓度的呕吐毒素标准溶液50μL/每孔，再加入经酶标抗体稀释液稀释至最佳工作浓度的酶标单克隆抗体溶液50μL每孔，25℃避光反应15min；洗涤4～5次后加入显色液100μL每孔，25℃显色5min，加入终止液50μL每孔，设定酶标仪于450nm处测定每孔吸光度值(OD值)；
[0018](3)称取2.0g待测薏苡仁粉末样本溶于10mL去离子水中，震荡3min，4000r
·
min
‑
1离心5min，取上清0.2mL溶于0.6mL去离子水中作为待测样品，代替上述测定步骤中的标准溶液采用上述测定步骤测得样品的OD450 nm值，代入标准曲线得到待测薏苡仁粉末中呕吐毒素的质量浓度。
[0019]本研究初步建立了薏苡仁中呕吐毒素残留检测的酶联免疫检测法，灵敏度高、特异性好、操作简便、检测成低、一次性检测样本量大等特点，能够更好地满足我国食品企业、政府监管部门等开展检测工作。该方法的IC
50
为2μg
·
kg
‑1，样本添加回收率为75％～95％，变异系数为5.6％～9.7％，与液相色谱法检测值本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种人工薏苡仁中呕吐毒素衍生化半抗原，其特征在于，具有式I所示的分子结构其核磁共振氢谱参数如下：1H
‑
NMR(CDCl3,300MHz)δ：11.0(s,1H,COOH)，6.54(d,1H,C＝CH)，4.26(d,1H,CH
‑
O
‑
)，4.06(s,1H,
‑
CH
‑
O)，3.58
‑
3.65(s,3H,OH)，2.59
‑
2.71(d,4H,
‑
CH2‑
)，1.46
‑
1.71(m,2H,
‑
CH
‑
)，1.01(s,3H,
‑
CH3)。2.一种人工薏苡仁中呕吐毒素人工抗原，是通过以下步骤制得：合成权利要求1所述的呕吐毒素半抗原合成：将50mg呕吐毒素溶于乙腈中，加入200μL醋酸，搅拌，再加入40mg巯基丙酸，80℃搅拌12h；停止反应，加水，加氢氧化钠水溶液调pH到13，加乙酸乙酯萃取，除去有机相，加盐酸调节pH到6，加乙酸乙酯萃取，有机相蒸干，石油醚洗涤结晶，得到所述的呕吐毒素衍生化半抗原；制备呕吐毒素人工抗原：将所述呕吐毒素衍生化半抗原分别与BSA和OVA偶联，作为免疫抗原(DON
‑
BSA)和包被抗原(DON
‑
OVA)。具体制备过程：取11mg呕吐毒素衍生化半抗原溶于1mL DMF中，取30mg DCC和30mg NHS溶于0.2mL水后加入半抗原溶液中，室温搅拌24h，得到溶液Ⅰ；称取50mg载体蛋白溶于3.8mL PBS中，得到溶液Ⅱ；将溶液Ⅰ逐滴缓慢滴加到溶液Ⅱ中，室温搅拌24h；用PBS于4℃透析3d，每天换3次透析液得呕吐毒素人工抗原。3.一种薏苡仁中呕吐毒素的酶联免...

【专利技术属性】
技术研发人员：南铁贵，袁媛，赵玉洋，詹志来，康利平，
申请(专利权)人：中国中医科学院中药研究所，
类型：发明
国别省市：