一种鸡肉基体尼卡巴嗪标准样品的制备方法及分析方法技术

本发明专利技术涉及一种鸡肉基体中尼卡巴嗪标准样品的制备方法及分析方法，制备方法包括：(1)基体标准样品的制备，取体重1000g

【技术实现步骤摘要】
一种鸡肉基体尼卡巴嗪标准样品的制备方法及分析方法


[0001]本专利技术涉及标准样品的制备方法，尤其是一种鸡肉基体尼卡巴嗪标准样品的制备方法及分析方法。

技术介绍

[0002]尼卡巴嗪为4,4'
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二硝基均二脲(DNC)和2
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羟基
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4,6二甲嘧啶(HDP)的复合物，是一种养禽业常用的性能优良、广谱、高效抗球虫药，对球虫第二代裂殖体有效，推荐剂量下，不会影响鸡对球虫产生免疫力，但应在高温季节慎用，产蛋期禁用。HDP在动物体内由尿液排出，代谢迅速。而DNC通过粪便排出，代谢缓慢，不能完全代谢而排除体外，因而在肌肉及其他组织中会出现不同程度的残留，人们食用该食物后会产生潜在危害。联合国粮农组织以及新西兰、日本和我国等均以DNC单体作为尼卡巴嗪的残留标识物。为规范尼卡巴嗪在养殖鸡群中的用药，很多国家规定了鸡肉中的尼卡巴嗪残留标识物和最高残留限量(MRL)。我国原农业部2002年发布了235号公告，规定了鸡肉中的尼卡巴嗪MRL为200μg/kg。
[0003]目前DNC的检测方法主要以HPLC和LC
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MS/MS居多，例如，专利申请CN113484433A公开了一种鸡饲料、预混料和饲料添加剂中氯羟吡啶、二硝托胺、尼卡巴嗪、磺胺喹恶啉、盐酸氯苯瓜和地克珠利6种抗球虫药的含量检测方法，主要步骤包括用0.1％三氯乙酸乙腈提取，50mg PSA净化，甲醇：5mmol/L乙酸铵水溶液体积比为8:2作为复溶液复溶，采用Agilent Extend
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C18(250mm
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4.6mm i.d.,5μm)色谱柱作为分析柱，波长选择270nm和340nm，进样量20uL，柱温25℃，使用Agilent 1260高效液相色谱系统(Agilent，DAD)进行分析。
[0004]为了检测鸡肉中的尼卡巴嗪含量，需要以鸡肉作为基体，而食品类基体比较复杂，可能出现假阳性结果的频率就会高。因此，研制含尼卡巴嗪的残留基体标准样品，以此优化尼卡巴嗪的检测方法，针对尼卡巴嗪残留检测以及质量控制存在重要意义。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是为了克服现有鸡肉样品测定尼卡巴嗪含量缺乏标准样品的问题，提供一种鸡肉基体尼卡巴嗪标准样品的制备方法及分析方法，采用本专利技术制备的标准样品，测试数据稳定性高，从而可以优化尼卡巴嗪的检测方法，对尼卡巴嗪残留检测以及质量控制具有重要意义。
[0006]具体方案如下：
[0007]一种鸡肉基体尼卡巴嗪标准样品的制备方法，包括以下步骤：
[0008](1)基体标准样品的制备
[0009]取体重1000g
‑
1200g的肉鸡，养殖过程中添加尼卡巴嗪，给药量按5～10mg/kg体重/次，每天1
‑
2次，连服7
‑
10天，然后宰杀取样；去毛后取鸡前胸肌肉，进行鸡肉组织匀浆：把鸡肉搁置在匀浆机中，1000
‑
4000rpm转速匀浆3
‑
10min，以4
‑
5kg/次的鸡肉量搅拌2
‑
4次；然后使用拍击式均质器100
‑
200次/min的频率拍击3
‑
10min，更换拍击2
‑
3次，制作成混合样，将混合样冷冻干燥、研磨、过筛、分装及保存得到含尼卡巴嗪兽药残留的鸡肉粉；
[0010](2)均匀性检验
[0011]采用液相色谱
‑
串联质谱法测定所述混合样的尼卡巴嗪含量，并检验所述混合样均匀性，利用方差分析法，采用F检验，将均匀性方差分析结果(S
bb
)与该特性值不确定度的预期目标进行比较，若不显著，则混合样视为均匀；否则返回到步骤(1)中；
[0012]将通过均匀性检测的混合样分别独立封装、灭菌，得到基体标准样品。
[0013]进一步的，步骤(1)基体标准样品的制备中，取体重1000g
‑
1200g的白羽鸡，养殖过程中添加尼卡巴嗪，给药量按5～10mg/kg体重/次，每天2次，连服7天，第7天宰杀取样；去毛后取鸡前胸肌肉，进行鸡肉组织匀浆：把鸡肉搁置在匀浆机中，3000rpm转速匀浆5min，以4kg/次的鸡肉量搅拌3次；然后使用拍击式均质器180次/min的频率拍击5min，更换拍击3次，制作成混合样，将混合样冷冻干燥、研磨、过筛、分装及保存得到含尼卡巴嗪兽药残留的鸡肉粉。
[0014]进一步的，步骤(2)均匀性检验中，采用液相色谱
‑
串联质谱法测定所述鸡肉粉的尼卡巴嗪含量，包括：
[0015]2.1样品前处理
[0016]准确称取鸡肉粉1g于50mL离心管中，加入3.0mL水充分混匀复原30min，再加入50ng内标,涡旋混匀，然后加入10.0mL乙腈，涡旋，超声提取10min，离心3min，转速8000rpm。取3.0mL离心后的上清液到5.00mL高速离心管,加入0.3gPSA粉末，快速振摇并涡旋1min，离心3min，转速15000rpm，，取上清液过0.2μm滤膜，供液相色谱
‑
串联质谱测定。
[0017]2.2标准溶液的配置
[0018]精密量取10μg/mL 4,4'
‑
二硝基均二苯脲标准工作液和10μg/mL 4,4'
‑
二硝基均二苯脲
‑
D8标准工作液适量，用乙腈水1:1溶液稀释，配制成4,4'
‑
二硝基均二苯脲
‑
D8浓度均为5ng/mL以及4,4'
‑
二硝基均二苯脲浓度为0.5、1、2、5、10、20和50ng/mL系列对照溶液，供液相色谱串联质谱法测定；
[0019]2.3进行液相色谱串联质谱测试，以特征离子质量色谱峰面积为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线，求回归方程和相关系数，用于计算样品中尼卡巴嗪的含量。
[0020]进一步的，液相色谱串联质谱测试时，色谱条件如下：色谱柱：柱温：35℃；流动相：A相为水，B相为乙腈；流速0.3mL/min；进样量5μL；梯度洗脱条件如下：
[0021]时间/min水/体积％甲醇/体积％0.0090102.0090102.1050503.5020807.0020807.01901010.009010
[0022]质谱条件为：多反应监测扫描模式；电喷雾离子源；负离子扫描；离子化电压:
‑
4500V；气帘气:35psi；离子源温度:550℃；喷雾气40psi；辅助加热气40psi；定性、定量离子对和碰撞能量条件如下：
[0023][0024]进一步的，步骤(2)均匀性检验中，将通过均匀性检测的鸡肉粉装入聚乙烯袋内袋中，再套上食品级包装外袋，贴上编号标签，使用60Co
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γ进行辐照杀菌，剂量为9
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种鸡肉基体尼卡巴嗪标准样品的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)基体标准样品的制备取体重1000g
‑
1200g的肉鸡，养殖过程中添加尼卡巴嗪，给药量按5～10mg/kg体重/次，每天1
‑
2次，连服7
‑
10天，然后宰杀取样；去毛后取鸡前胸肌肉，进行鸡肉组织匀浆：把鸡肉搁置在匀浆机中，1000
‑
4000rpm转速匀浆3
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10min，以4
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5kg/次的鸡肉量搅拌2
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4次；然后使用拍击式均质器100
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200次/min的频率拍击3
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10min，更换拍击2
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3次，制作成混合样，将混合样冷冻干燥、研磨、过筛、分装及保存得到含尼卡巴嗪残留的鸡肉粉；(2)均匀性检验采用液相色谱
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串联质谱法测定所述含尼卡巴嗪残留的鸡肉粉的尼卡巴嗪含量，并检验所述混合样均匀性，利用方差分析法，采用F检验，将均匀性方差分析结果S
bb
与该特性值不确定度的预期目标进行比较，若不显著，则混合样视为均匀；否则返回到步骤(1)中；将通过均匀性检测的混合样分别独立封装、灭菌，得到基体标准样品。2.根据权利要求1所述鸡肉基体尼卡巴嗪标准样品的制备方法，其特征在于：步骤(1)基体标准样品的制备中，取体重1000g
‑
1200g的白羽鸡，养殖过程中添加尼卡巴嗪，给药量按5～10mg/kg体重/次，每天2次，连服7天，第7天宰杀取样；去毛后取鸡前胸肌肉，进行鸡肉组织匀浆：把鸡肉搁置在匀浆机中，3000rpm转速匀浆5min，以4kg/次的鸡肉量搅拌3次；然后使用拍击式均质器180次/min的频率拍击5min，更换拍击3次，制作成混合样，制作成混合样，将混合样冷冻干燥、研磨、过筛、分装及保存得到含尼卡巴嗪残留的鸡肉粉。3.根据权利要求1所述鸡肉基体尼卡巴嗪标准样品的制备方法，其特征在于：步骤(2)均匀性检验中，采用液相色谱
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串联质谱法测定所述混合样的尼卡巴嗪含量，包括：2.1样品前处理准确称取鸡肉粉1g于50mL离心管中，加入3.0mL水充分混匀复原30min，再加入50ng内标,涡旋混匀，然后加入10.0mL乙腈，涡旋，超声提取10min，离心3min，转速8000rpm；取3.0mL离心后的上清液到5.00mL高速离心管,加入0.3gPSA粉末，快速振摇并涡旋1min，离心3min，转速15000rpm，取上清液过0.2μm滤膜，供液相色谱
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串联质谱测定；2.2标准溶液的配置精密量取10μg/mL 4,4'
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二硝基均二苯脲标准工作液和10μg/mL 4,4'
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二硝基均二苯脲
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D8标准工作液适量，用乙腈水体积比1:1溶液稀释，配制成4,4'
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二硝基均二苯脲
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D8浓度均为5ng/mL以及4,4'
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二硝基均二苯脲浓度为0.5、1、2、5、10、20和50ng/mL系列对照溶液，供液相色谱串联质谱法测定；2.3进行液相色谱串联质谱测试，以特征离子质量色谱峰面积为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线，求回归方程和相关系数，用于计算样品中尼卡巴嗪的含量。4.根据权利要求3所述鸡肉基体尼卡巴嗪标准样品的制备方法，其特征在于：液相色谱串联质谱测试时，色谱条件如下：色谱柱：柱温：35℃；流动相：A相为水，B相为乙腈；流速0.3mL/min；进样量5μL；梯度洗脱条件如下：
质谱条件为：多反应监测扫描模式；电喷雾离子源；负离子扫描；离子化电压:
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4500V；气帘气:35psi；离子源温度:550℃；喷雾气40psi；辅助加热气40psi；定性、定量离子对和碰撞能量条件如下：5.根据权利要求1所述鸡肉基体尼卡巴嗪标准样品的制备方法，其特征在于：步骤(2)均匀性检验中，将通过均匀性检测的鸡肉粉装入聚乙烯袋内袋中，再套上食品级包装外袋，贴上编号标签，使用60Co
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γ进行辐照杀菌，剂量为9
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10KGy，杀菌后置于
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18℃及以下温度的冰箱中保存，得到基体标准样品。6.一种鸡肉基体尼卡巴嗪标准样品的分析方法，采用权利要求1
‑
5任一项所述鸡肉基体尼卡巴嗪标准样品的制备方法制得的基体标准样品，其特征在于：包括稳定性检验、定值和不确定度计算，具体如下：(1)稳定性检验1.1短期稳定性检验将基体标准样品分别置于
‑
18℃、4℃、室温条件下保存14d后测定尼卡巴嗪含量，每个样品重复测试2
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3次，采用单因素方差分析法F
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检验，在显著水平α＝0.05时，若F值＜F0.05(2，6)，则说明结果均未见显著差异，从而判定基体标准样品短期是稳定的；1.2长期稳定性检验采用经典稳...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐敦明，肖晶，刘正才，沈鹭英，王伟，林永健，
申请(专利权)人：国家食品安全风险评估中心，
类型：发明
国别省市：