一种融合基因、其所编码的蛋白及其在鱼类弹状病毒口服疫苗的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种融合基因、其所编码的蛋白及其在鱼类弹状病毒口服疫苗的应用。所述融合基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明专利技术方案通过将经密码子优化后的融合基因经原核表达，制备得到Lactococcus lactis NZ9000pNZ8148

【技术实现步骤摘要】
SEQ ID No.5所示。
[0014]根据本专利技术的第二方面，提出了一种上述融合基因编码的融合蛋白。
[0015]在本专利技术的一些实施方式中，所述融合蛋白的制备方法包括以下步骤：
[0016]S1、将如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列连接到载体中，得到重组质粒；
[0017]S2、将重组质粒转入大肠杆菌，培养后提取重组质粒；
[0018]S3、将经步骤S2提取得到的重组质粒转化至乳酸菌，得到重组乳酸菌；
[0019]S4、诱导步骤S3得到的重组乳酸菌表达得到所述融合蛋白。
[0020]在本专利技术的一些实施方式中，所述载体选自pNZ8148质粒。
[0021]在本专利技术的一些实施方式中，所述大肠杆菌选自大肠杆菌DH5α或MC1061。
[0022]在本专利技术的一些实施方式中，所述步骤S2中，大肠杆菌的培养操作具体为将大肠 杆菌菌体涂布于含氯霉素的培养基进行培养。
[0023]在本专利技术的一些实施方式中，所述步骤S2中，提取重组质粒的操作具体为从经培 养后的含氯霉素的培养基中挑取阳性单菌落进行提取操作。
[0024]在本专利技术的一些实施方式中，所述步骤S3中，转化为电转化。
[0025]在本专利技术的一些实施方式中，所述步骤S3中，所述乳酸菌为乳酸乳球菌。
[0026]在本专利技术的一些实施方式中，所述步骤S4中，诱导表达采用的诱导剂为Nisin；优 选地，所述Nisin的浓度为5～15μg/L。
[0027]在本专利技术的一些实施方式中，所述步骤S4中，诱导表达时间为2～8h；优选地， 所述诱导时间为4h。
[0028]在本专利技术的一些实施方式中，所述步骤S4中，诱导表达温度为37℃。
[0029]根据本专利技术的第三方面提出了一种具有上述融合基因或上述的融合蛋白的重组表 达载体、表达盒、转基因细胞系或转基因重组菌。
[0030]在本专利技术的一些实施方式中，所述重组表达载体为将上述融合基因亚克隆至 pNZ8148原核表达载体中，构建得到的。
[0031]在本专利技术的一些实施方式中，所述的转基因重组菌为转基因重组乳酸乳球菌；优选 地，所述重组乳酸乳球菌为Lactococcus lactis NZ9000
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MSRGP，其保藏编号为CCTCCNO：M2021448；保藏信息如下：保藏号为CCTCC NO：M2021448的重组乳酸乳球菌 已于2021年4月25日在中国典型培养物保藏中心CCTCC(地址：武汉市武汉大学)注册 保藏。
[0032]在本专利技术的一些实施方式中，所述宿主菌为大肠杆菌MC1061和/或乳酸乳球菌。
[0033]本专利技术第四方面提出一种上述融合基因应用，所述应用为在制备预防鱼类弹状病毒 制剂中的应用。
[0034]在本专利技术的一些实施方式中，所述应用为上述基因在制备口服疫苗中的应用。
[0035]一种口服疫苗，所述口服疫苗为上述融合基因、融合蛋白或含有上述融合基因、融 合蛋白的表达载体、表达盒、转基因细胞系或转基因重组菌。
[0036]在本专利技术的一些实施方式中，所述疫苗还包括佐剂，所述佐剂为Essai GR 01 PR佐 剂；通过佐剂的添加，使得口服疫苗抗原通过油性佐剂包裹而固定在饲料上，对鱼进行 口服免疫；且这个油性佐剂能包裹住抗原，在池塘投喂的真实免疫过程中，不因为碰到 水就使得抗原马上溶解于水，而且包裹住抗原，可以在鱼的胃肠道中耐胃酸等恶劣环境， 不轻易被胃酸、各种酶等直接给消化破坏掉，保护口服疫苗到达肠道，起免疫的作用。
[0037]在本专利技术的一些实施方式中，所述融合蛋白与佐剂的质量比为(1～4)：(6～8)。
[0038]在本专利技术的一些实施方式中，所述融合蛋白与佐剂混合使用。
[0039]在本专利技术的一些实施方式中，所述疫苗还包括饲料，所述饲料与融合蛋白和佐剂的 混合物的质量比为(1～3)：(3～10)。
[0040]根据本专利技术实施方式的加州鲈弹状病毒乳酸菌载体口服疫苗，至少具有如下有益效 果：
[0041](1)与未经优化的基因相比，密码子优化的MSRGP基因序列中乳酸乳球菌偏好 的密码子出现频率增加，但是其编码的MSRGP蛋白氨基酸序列不变，从而使其更适于 在乳酸乳球菌中的蛋白表达，更有利于更利于提高目的蛋白表达量；由于目前对基因序 列的密码子优化尚没有统一的标准或原则，因此不同的研究人员完全会设计出不同的核 苷酸序列用于目标蛋白质的表达，相应地表达效率也可能存在明显差异，根据本申请优 化的核苷酸编码序列，克服了上述缺陷，提高了MSRGP基因蛋白表达水平；将该优化 后的基因用于构建核酸疫苗，更有效地刺激了加州鲈免疫系统，产生了中和抗体，体现 了良好的免疫原性；同时，在密码子优化的基础上，将该序列与usp45基因进行融合， 更有效地促进蛋白的分泌和提高目的蛋白诱导抗体产生的能力，可以短时间制备得到大 量的疫苗，可以高效用于加州鲈弹状病毒的防治。
[0042](2)与其它加州鲈弹状病毒疫苗，具有以下明显的优势：第一，本专利技术中乳酸菌 是食品级的安全微生物，不存在其它弱毒疫苗、减毒活疫苗等隐藏的毒力返强的危险， 也不存在其它类似芽孢杆菌表达系统中，芽孢杆菌对鱼体和人体的潜在危害；第二，本 专利技术中外源蛋白在乳酸菌中表达后无需分离纯化，能降低疫苗生产的成本，比大肠杆菌 等表达后需要纯化的疫苗成本低；第三，采用乳酸菌增强疫苗的免疫效果；第四，本发 明中加州鲈口服疫苗非常适合于加州鲈鱼苗的养殖实践应用，因为鱼苗尺寸太小，无法 进行疫苗注射免疫；第五，与加州鲈注射免疫相比，本专利技术中加州鲈口服疫苗能够极大 地减少疫苗免疫的工作量和劳动力成本，提高养殖户使用疫苗的便利程度，而且也能减 少鱼体应激和注射部位的不良反应；第六，与加州鲈浸泡免疫相比，浸泡免疫这种方式 需要加强免疫，但是在养殖过程中很难把全部鱼从池塘中捞起来再次浸泡免疫(捞网会 增加鱼的应激导致死亡)，而本专利技术中口服疫苗可以每天和佐剂、饲料一起搅拌后投喂 加州鲈鱼，不需要全部鱼捞网，且多次投喂增强免疫，与浸泡免疫相比，具有较好的免 疫效果和操作实用性；第七，为避免为胃的酸性环境等破坏，减少肠道中疫苗剂量和免 疫原性，本专利技术方案首次采用了与Essai GR 01 PR佐剂进行乳化从而包裹保护住口服疫 苗的方法，且Essai GR 01 PR佐剂对本专利技术方案制备得到的疫苗具有协同增效作用，可 以提高疫苗的免疫能力。
附图说明
[0043]下面结合附图和实施例对本专利技术做进一步的说明，其中：
[0044]图1为本专利技术实施例1中的优化的序列与原序列的序列对比结果图；
[0045]图2为本专利技术实施例1中的pNZ8148质粒双酶切的结果图，其中M为marker；
[0046]图3为本专利技术实施例1中的重组质粒pNZ8148
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msrgp和pNZ8148 PCR扩增鉴定图， 其中，M为marker，1为重组质粒pNZ8148
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msrgp，2、3为p本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种融合基因，其特征在于，所述融合基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。2.根据权利要求1所述融合基因，其特征在于，所述融合基因包含usp45和msrgp基因。3.根据权利要求2所述融合基因，其特征在于，所述融合基因还包含连接序列和标签序列。4.权利要求1所述的融合基因所编码的融合蛋白。5.含有如权利要求1
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3任一项所述的融合基因或权利要求4所述的融合蛋白的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或转基因重组菌。6.根据权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于，为将权利要求1所述的融合基因亚克隆至pNZ8148原核表达载体中，构建得到的。7.根据权利要求5所述的转基因重组菌，其特征在于，该转基因重组菌为转基因重组乳酸乳球菌；优选地，所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：赖迎迢，黄志斌，巩华，陶家发，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院珠江水产研究所，
类型：发明
国别省市：