一种RPA可视化快速检测出血性大肠埃希氏菌O157:H7的检测试剂盒制造技术

本发明专利技术提供一种RPA可视化快速检测出血性大肠埃希氏菌O157:H7的检测试剂盒，包括：EHECO157:H7浓度参照管、EHECO157:H7阳性对照标准品、EHECO157:H7阴性对照标准品、样品处理管、检测管、缓冲液I、缓冲液II、显色剂；本发明专利技术在核酸提取过程和核酸扩增过程对仪器要求低，检测特异性强与其他腹泻病原体无交叉反应，灵敏度是PCR检测10

【技术实现步骤摘要】
一种RPA可视化快速检测出血性大肠埃希氏菌O157:H7的检测试剂盒


[0001]本专利技术涉及一种腹泻性病原菌的提取检测试剂盒，特别是涉及一种出血性大肠埃希氏菌O157:H7的检测试剂盒。

技术介绍

[0002]出血性大肠埃希氏菌O157:H7(Enterohemorrhagic Escherichia coli，EHEC O157:H7)是肠出血性大肠杆菌常见的血清型，以污染食物和水为主要传播途径。在世界各地都有不同规模的EHEC O157:H7爆发和流行，每年有280万人感染，因此在世界范围内都受到关注。感染EHEC O157:H7可以引起病人腹泻、出血性结肠炎、溶血性尿毒综合征，甚至死亡，死亡率可以达5％
‑
10％。此外，EHEC O157:H7的致病量很低，食入不足10个细菌就能致病。而EHEC O157:H7的生存能力非常强，即使在人类食物链中遇到各种恶劣条件依然存活，使其可以在食物中长期存在。目前对EHEC O157:H7的感染机制尚不完全清楚，且临床上缺乏有效的治疗方法，因此建立快速且灵敏检测EHEC O157:H7的方法，对预防和控制EHEC O157:H7在环境和食品中的传播具有重要意义。
[0003]目前对EHEC O157:H7的检测方法有很多种，检测EHEC O157:H7的常用方法包括传统细菌检测法、免疫学分析法、分子生物学检测、微流控传感器检测法等。虽然这些方法使用较广泛，但传统细菌检测法分析时间通常需要2～3d，耗时耗力；免疫学分析法虽然缩短，但样品预处理时间长，易被污染，也容易出现假阳性结果；相对于传统检测方法，核酸检测方法有诸多优势，比如PCR检测的特异性、敏感性都很好，但是检测速度依然在120min左右，而且需要依赖昂贵的仪器设备。
[0004]现行的国家标准GB4789.6
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2016，其方法是先对样品增菌，然后用平板法进行多次筛选及生化试验鉴别，最后用PCR进行确认试验，操作繁琐且周期很长，而且需要精准昂贵的PCR仪和完善的实验环境，限制了在基层实验室和现场的应用。

技术实现思路

[0005]鉴于以上所述现有技术的缺点，本专利技术根据EHEC O157:H7的rfbE基因保守序列，设计RPA检测引物，运用SYBR Green I作为核酸显色剂，建立可视化RPA检测方法，并检测其特异性和敏感性，本研究建立的方法能够在现场快速检测EHEC O157:H7，不需要复杂的仪器设备且操作简单、灵敏度高，可以在医院、口岸、食品监测现场以及一些基层实验室等进行应用。
[0006]为实现上述目的及其他相关目的，本专利技术提供一种RPA可视化快速检测出血性大肠埃希氏菌O157:H7的检测试剂盒包括：EHEC O157:H7浓度参照管、EHEC O157:H7阳性对照标准品、EHEC O157:H7阴性对照标准品、样品处理管、检测管、缓冲液I、缓冲液II、显色剂；所述EHEC O157:H7浓度参照管为装有5管不同颜色液体的PCR 8联排管；所述EHEC O157:H7阳性对照标准品为EHEC O157:H7标准菌株基因组DNA的溶液，其浓度为10
‑
2ng/μL
‑
100ng/μ
L，优选1ng/μL；所述EHEC O157:H7阴性对照标准品为不含有核酸的无菌去离子水；所述样品处理管为包含100μL
‑
500μL的EHEC O157:H7核酸提取试剂的无菌EP管；所述检测管为包含RPA通用反应试剂冻干制剂的TwistAmp反应管；所述缓冲液I为含有EHEC O157:H7检测上游引物F2和EHEC O157:H7检测下游引物R2的RPA通用反应缓冲液，所述缓冲液I中含有EHEC O157:H7检测上游引物F2浓度为0.28μM
‑
0.85μM；所述EHEC O157:H7检测下游引物R2浓度为0.28μM
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0.85μM；所述缓冲液II为含有280mM醋酸镁的溶液；所述显色剂为SYBR Green I溶液，其浓度为100
×‑
10000
×
之间。
[0007]优选地，所述EHEC O157:H7浓度参照管获取方法为：按照本专利技术检测待测样品中的EHEC O157:H7的步骤检测EHEC O157:H7基因组DNA浓度为10
‑3ng/μL、10
‑4ng/μL、10
‑5ng/μL的三个样品以及EHEC O157:H7阴性对照标准品、EHEC O157:H7阳性对照标准品，检测完成后得到5个带颜色的检测管，参照上述检测管结果颜色，用橙色和绿色染料配制5份颜色与之对应一致的染色液，依次按顺序将5份配制的染色液加入PCR 8联排管的5个孔中，盖上8联排盖子，在盖子或8联排管的外侧依次标注为10
‑3ng/μL、10
‑4ng/μL、10
‑5ng/μL、阴性、阳性，整体作为EHEC O157:H7浓度参照管；所述EHEC O157:H7浓度参照管中的液体容量为50μL
‑
200μL，优选为200μL；所述5个带颜色的检测管结果颜色依次分别为绿色、黄绿色、浅黄绿色、橙红色、绿色；所述本专利技术检测待测样品中的EHEC O157:H7的步骤为：(1)待测样品核酸提取；(2)配制本专利技术的待测样品的检测体系：33.5μL缓冲液I加入到检测管，吹打混匀；加入12μL待测核酸，吹打混匀；2.5μL缓冲液II加入到检测管，吹打混匀；将2μL的显色剂滴加在检测管的盖子内侧上；(3)盖上检测管盖子，将检测管放置25℃
‑
45℃中反应10min
‑
25min；(4)结果检测：将检测管上下颠倒，充分混匀检测管中液体；检测管在室温放置1min
‑
5min；每次检测反应均同步检测EHEC O157:H7阳性对照标准品、EHEC O157:H7阴性对照标准品各一份；(5)结果判读：首先检测EHEC O157:H7阳性对照标准品的检测管，比对EHEC O157:H7浓度参照管，与EHEC O157:H7浓度参照管中标注为“阳性”的管的颜色一致为绿色，且检测EHEC O157:H7阴性对照标准品的检测管比对EHEC O157:H7浓度参照管，与EHEC O157:H7浓度参照管中标注为“阴性”的管的颜色一致为橙红色，判断本次检测结果可信，否则结果不可信，需要重新检测；检测待测样品的检测管比对EHEC O157:H7浓度参照管，颜色为橙红色且与标注为“阴性”的管的颜色一致，判断为阴性；检测待测样品的检测管颜色为绿色且与EHEC O157:H7浓度参照管中标注为“阳性”的管的颜色相近，判断为阳性，同时判断待测样品中提取得到的待测核酸浓度大于10
‑3ng/μL；检测待测样品的检测管颜色为黄绿色，且与EHEC O157:H7浓度参照管中标注为“10
‑4ng/μL”的管的颜色相近，判断为阳性，同时判断待测样品中提取得到的待测核酸浓度接本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种RPA可视化快速检测出血性大肠埃希氏菌O157:H7的检测试剂盒，其特征在于，所述一种RPA可视化快速检测出血性大肠埃希氏菌O157:H7的检测试剂盒包括：EHEC O157:H7浓度参照管、EHEC O157:H7阳性对照标准品、EHEC O157:H7阴性对照标准品、样品处理管、检测管、缓冲液I、缓冲液II、显色剂；所述EHEC O157:H7浓度参照管为装有5管不同颜色液体的PCR 8联排管；所述EHEC O157:H7阳性对照标准品为EHEC O157:H7标准菌株基因组DNA的溶液，其浓度为10
‑2ng/μL
‑
100ng/μL，优选1ng/μL；所述EHEC O157:H7阴性对照标准品为不含有核酸的无菌去离子水；所述样品处理管为包含100μL
‑
500μL的EHEC O157:H7核酸提取试剂的无菌EP管；所述检测管为包含RPA通用反应试剂冻干制剂的Twist Amp反应管；所述缓冲液I为含有EHEC O157:H7检测上游引物F2和EHEC O157:H7检测下游引物R2的RPA通用反应缓冲液，所述缓冲液I中含有EHEC O157:H7检测上游引物F2浓度为0.28μM
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0.85μM；所述EHEC O157:H7检测下游引物R2浓度为0.28μM
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0.85μM；所述缓冲液II为含有280mM醋酸镁的溶液；所述显色剂为SYBR Green I溶液，其浓度为100
×‑
10000
×
之间。2.根据权利要求1所述的一种RPA可视化快速检测出血性大肠埃希氏菌O157:H7的检测试剂盒，其特征在于：所述EHEC O157:H7浓度参照管获取方法为：按照本发明检测待测样品中的EHEC O157:H7的步骤检测EHEC O157:H7基因组DNA浓度为10
‑3ng/μL、10
‑4ng/μL、10
‑5ng/μL的三个样品以及EHEC O157:H7阴性对照标准品、EHEC O157:H7阳性对照标准品，检测完成后得到5个带颜色的检测管，参照上述检测管结果颜色，用橙色和绿色染料配制5份颜色与之对应一致的染色液，依次按顺序将5份配制的染色液加入PCR 8联排管的5个孔中，盖上8联排盖子，在盖子或8联排管的外侧依次标注为10
‑3ng/μL、10
‑4ng/μL、10
‑5ng/μL、阴性、阳性，整体作为EHEC O157:H7浓度参照管；所述EHEC O157:H7浓度参照管中的液体容量为50μL
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200μL，优选为200μL；所述5个带颜色的检测管结果颜色依次分别为绿色、黄绿色、浅黄绿色、橙红色、绿色；所述本发明检测待测样品中的EHEC O157:H7的步骤为：(1)待测样品核酸提取；(2)配制本发明的待测样品的检测体系：33.5μL缓冲液I加入到检测管，吹打混匀；加入12μL待测核酸，吹打混匀；2.5μL缓冲液II加入到检测管，吹打混匀；将2μL的显色剂滴加在检测管的盖子内侧上；(3)盖上检测管盖子，将检测管放置25℃
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45℃中反应10min
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25min；(4)结果检测：将检测管上下颠倒，充分混匀检测管中液体；检测管在室温放置1min
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5min；每次检测反应均同步检测EHEC O157:H7阳性对照标准品、EHEC O157:H7阴性对照标准品各一份；(5)结果判读：首先检测EHEC O157:H7阳性对照标准品的检测管，比对EHEC O157:H7浓度参照管，与EHEC O157:H7浓度参照管中标注为“阳性”的管的颜色一致为绿色，且检测EHEC O157:H7阴性对照标准品的检测管比对EHEC O157:H7浓度参照管，与EHEC O157:H7浓度参照管中标注为“阴性”的管的颜色一致为橙红色，判断本次检测结果可信，否则结果不可信，需要重新检测；检测待测样品的检测管比对EHEC O157:H7浓度参照管，颜色为橙红色且与标注为“阴性”的管的颜色一致，判断为阴性；检测待测样品的检测管颜色为绿色且与EHEC O157:H7浓度参照管中标注为“阳性”的管的颜色相近，判断为阳性，同时判断待测样品中提取得到的待测核酸浓度大于10
‑3ng/μL；检测待测样品的检测管颜色为黄绿色，且与EHEC O157:H7浓
度参照管中标注为“10
‑4ng/μL”的管的颜色...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐颖，刘海江，陈晓光，董梅，梁洁，张瑾，滕新栋，徐翮飞，
申请(专利权)人：青岛国际旅行卫生保健中心青岛海关口岸门诊部，
类型：发明
国别省市：