分枝杆菌属物种的检测制造技术

本发明专利技术提供用于检测样品中的所需分枝杆菌属物种的方法，所述方法包含以下步骤：a)将分枝杆菌噬菌体偶联的顺磁粒子与所述样品在适合于准许所述分枝杆菌噬菌体与所述样品中存在的任何分枝杆菌噬菌体灵敏的分枝杆菌属物种结合的条件下混合，以形成反应混合物；b)向所述样品施加磁场以收集和分离具有结合的所需分枝杆菌属物种的分枝杆菌噬菌体偶联的顺磁粒子；c)在准许所述分枝杆菌属噬菌体在活分枝杆菌属物种细胞内复制且裂解所述活分枝杆菌属物种细胞的条件下，孵育具有结合的分枝杆菌属物种的所分离的顺磁粒子的悬浮液；d)从所述孵育的悬浮液回收裂解的分枝杆菌属物种DNA的核苷酸，任选地DNA；和e)分析从所述裂解的分枝杆菌属物种释放的核苷酸，任选地DNA，以鉴定在所述所需分枝杆菌属物种中存在的标志核苷酸，任选地DNA序列。本发明专利技术还提供分枝杆菌噬菌体的用途；和适合于进行前述方法的试剂盒。盒。盒。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】分枝杆菌属物种的检测
[0001]由于传染病已变为危及全世界数百万人生命的问题，因此病原菌的检测已成为人们最感兴趣的领域。
[0002]分枝杆菌属为放线菌的一个属。在这个属中识别出超过190种物种。这个属包括已知在动物和人类中引起严重疾病的病原体，包括结核(结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis))、鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium)类结核亚种(约氏病(Johne's disease))和麻疯病(麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae))。
[0003]优选的分枝杆菌属物种为病原性的。
[0004]病原性分枝杆菌属物种包括但不限于：
[0005]·
缓慢生长(鲁尼恩氏组I、II和III)物种，如结核分枝杆菌复合群(MTBC)成员是人类和动物结核的病原体。这个复合群中的物种包括：非洲分枝杆菌(M.africanum)、牛分枝杆菌、牛分枝杆菌BCG、卡内蒂分枝杆菌(M.canetti)、羊分枝杆菌(M.caprae)、微小分枝杆菌(M.microti)、芒吉分枝杆菌(M.mungi)、稻分枝杆菌(M.orygis)、海豹分枝杆菌(M.pinnipedii)、苏氏分枝杆菌(M.suricattae)、结核分枝杆菌，人类结核的主要原因；
[0006]·
鸟分枝杆菌复合群
‑
一种在播散性感染中但非肺感染中曾经是AIDS患者死亡的重要原因的物种组。这个复合群中的物种包括：鸟分枝杆菌鸟亚种(M.aviumsubsp.avium)；鸟分枝杆类菌结核亚种(M.aviumsubsp.paratuberculosis)，其已涉及人类的克罗恩氏病(Crohn's disease)且是反刍动物的约氏病(Johne's disease)的病原体，所述反刍动物如牛和绵羊；鸟分枝杆菌唾液亚种(M.avium subsp.silvaticum)；鸟分枝杆菌人亚种(M.avium subsp.hominissuis)；哥伦比亚分枝杆菌(M.colombiense)；印度分枝杆菌(M.indicus pranii)；胞内分枝杆菌(M.intracellulare)；
[0007]·
产生细菌内酯的分枝杆菌，如溃疡分枝杆菌(M.ulcerans)，其引起“布路里(Buruli)”或“拜恩斯代尔(Bairnsdale)”溃疡；
[0008]·
未分组的，如麻风分枝杆菌，其引起麻疯病；弥漫型麻风分枝杆菌(M.lepromatosis)(2008年描述的另一(不太重要的)麻疯病原因)；海分枝杆菌(M.marinum)(引起一种称为水族馆肉芽肿的罕见疾病)。
[0009]本专利技术涉及一种用于检测活分枝杆菌属物种的方法，所述分枝杆菌属物种如但不限于鸟分枝杆菌复合群，包括鸟分枝杆菌和鸟分枝杆菌类结核亚种，以及牛分枝杆菌和结核分枝杆菌。本专利技术还涉及一种用于所述方法中的试剂盒。
[0010]已知鸟分枝杆菌类结核亚种(MAP)在动物中引起疾病且可在人类中引起疾病。MAP是分枝杆菌属的革兰氏阳性细菌。所述细菌是非运动的且是杆状的，其平均长度为大致1.5微米。所述细菌基因组含于单一环状染色体内，其长度大约为5Mbp。这种细菌是反刍动物中约氏病(JD，也被称为类结核病)的病原体。约氏病可引起产奶减少、牛体重持续减轻和难治性腹泻且甚至死亡。
[0011]感染最初在摄入被污染的食物或水之后在胃肠道的淋巴组织中发生。感染在长达10年不呈现临床症状，且可仅在免疫响应开始时诊断出。由于较长的潜伏期，仅降低疾病速
率并非提供针对感染的免疫性的疫苗接种已被认为是不可行的。
[0012]研究也已显示，在人类中，MAP与克罗恩氏病相关，且潜在地与其它慢性疾病，如1型糖尿病、多发性硬化、桥本氏甲状腺炎(Hashimoto
’
s thyroiditis)相关。MAP导致牛和绵羊以及其它反刍动物的主要感染。此外，MAP还可从原生动物、动物(如兔、马鹿、野牛)和其它野生动物中分离。其存在已在食肉鸟类、灵长类动物和人体中报告。感染的动物显示顽固腹泻伴持续腹泻症状，患病动物呈现贫血伴随渐进性体重减轻。MAP感染潜伏期是长且缓慢的过程，其可在无症状宿主中出现，所述宿主在其粪便中排出活细菌，导致其它健康动物感染。
[0013]检测人或动物中分枝杆菌属物种的存在对于诊断分枝杆菌感染是有意义的。分枝杆菌属物种感染的快速且可靠的检测对于控制疾病而言是很重要的，且使用高通量技术的能力允许筛选大量样品。举例来说，非常有价值的是提供高通量筛选，可快速且可靠地测试来自牛群内的个体动物的样品的牛分枝杆菌(牛TB)或鸟分枝杆菌类结核亚种(约氏病)，所述两者均为在英国的地方性牛疾病。两种分枝杆菌属物种可在暴露于牛分枝杆菌或MAP的动物血液中检测到，即使在它们处于疾病的亚临床阶段时。畜群内的这些生物体的快速且可靠检测在控制疾病中是极其重要的步骤。
[0014]目前用于检测活分枝杆菌属物种的快速方法能够检测和计数两天或三天内的血液中的活MAP。然而，所使用的方法是劳动密集型的，且将难以放大以用于高通量测定样品。在其中需要测试来自整个畜群的动物的兽医学环境中，通常需要同时测试数百个样品，且目前方法太昂贵且劳动密集而无法进行大规模测试。
[0015]TB和约氏病的目前临床标准测试是基于抗体的(免疫响应)测试。基于抗体的测试检测宿主免疫系统对于生物体的响应并非检测活生物体。已知这些测试的灵敏度在用作诊断法时很低，从而在得到明确的阳性结果之前需要重复结果或晚期感染。基于抗体的测试的特定缺点是，这些测试还不能区分已感染动物和疫苗接种动物。在用于检测分枝杆菌属物种的先前基于PCR的方法中，测定的灵敏度受到从在物理上稳健且难以裂解的分枝杆菌属物种回收DNA的能力限制。此外，先前基于PCR的方法不容易区分活细胞和死细胞。尤其在食品工业中，区分活的和死分枝杆菌属物种的能力是极其重要的，这是因为加工食物可能仍含有不活化细胞的DNA。潜在地，区分活的和死的分枝杆菌属物种的能力在使用血液样品的临床诊断中也是很重要的，因为巨噬细胞内的死细胞也将被检测到，即使动物或人类正在从感染恢复。
[0016]许多主要引起疾病的分枝杆菌属物种，如鸟分枝杆菌类结核亚种(MAP)、结核分枝杆菌和牛分枝杆菌是缓慢生长的，且因此难以培养。培养这些物种所花费的时长使得难以使用培养作为感染的诊断测试。
[0017]近年来，对于基于噬菌体的方法作为培养的潜在替代方案以用于快速检测和计数活MAP的关注增加。用于检测MAP的基于噬菌体的测定首次由Stanley等人(2007)报告，他们证实，用于检测痰中结核分枝杆菌的FASTPlaqueTB噬菌体扩增测定(那时可从Biotec Laboratories,Ipswich,UK商购)可改用作检测牛奶中的活MAP。Foddai等人(2009)随后优化FASTPlaqueTB测定条件以确保精确定量奶中本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于检测样品中的所需分枝杆菌属物种的方法，所述方法包含以下步骤：a)将分枝杆菌噬菌体偶联的顺磁粒子与所述样品在适合于准许所述分枝杆菌噬菌体与所述样品中存在的任何分枝杆菌噬菌体灵敏的分枝杆菌属物种结合的条件下混合，以形成反应混合物；b)向所述样品施加磁场以收集和分离具有结合的所需分枝杆菌属物种的分枝杆菌噬菌体偶联的顺磁粒子；c)在准许所述分枝杆菌属噬菌体在活分枝杆菌属物种细胞内复制且裂解所述活分枝杆菌属物种细胞的条件下，孵育具有结合的分枝杆菌属物种的所分离的顺磁粒子的悬浮液；d)从所述孵育的悬浮液回收裂解的分枝杆菌属物种的核苷酸，任选地DNA；和e)分析从所述裂解的分枝杆菌属物种释放的核苷酸，任选地DNA，以鉴定在所述所需分枝杆菌属物种中存在的标志核苷酸，任选地DNA序列。2.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤c)之前，洗涤收集的具有结合的分枝杆菌属物种的顺磁粒子以去除不是具有结合的所需分枝杆菌属物种的顺磁粒子的残余样品，且再悬浮于较小体积中。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中进行所述步骤c)孵育到细胞裂解终点。4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中在步骤c)中，在37℃下孵育具有结合的所需分枝杆菌属物种的所分离的顺磁粒子的所述悬浮液1到5小时，任选地约4小时，以准许分枝杆菌噬菌体在活分枝杆菌属物种细胞内复制且裂解所述活分枝杆菌属物种细胞。5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述核苷酸是DNA；且步骤d)包含离心所述孵育的悬浮液以从所述孵育的悬浮液回收来自上清相的所需裂解的分枝杆菌属物种DNA。6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中步骤e)包含基于探针的qPCR。7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中在步骤c)之后，使所述孵育的悬浮液经受热激条件。8.根据权利要求7所述的方法，其中所述热激条件包括在40到70℃范围内的温度持续至少15秒到1分钟的时间段；任选地约55℃持续约1分钟，以确保从因内部分枝杆菌噬菌体作用而裂解或减弱的细胞最大释放分枝杆菌属物种核苷酸，任选地DNA。9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述分枝杆菌噬菌体选自Barnyard分枝杆菌噬菌体、Black Raspberry分枝杆菌噬菌体、Bxz2分枝杆菌噬菌体、Che8分枝杆菌噬菌体、L5分枝杆菌噬菌体、Omega分枝杆菌噬菌体、PBI1分枝杆菌噬菌体、PG2分枝杆菌噬菌体、Rosebush分枝杆菌噬菌体、SB1分枝杆菌噬菌体、Cooper分枝杆菌噬菌体、Wildcat分枝杆菌噬菌体、TM4分枝杆菌噬菌体和D29分枝杆菌噬菌体；任选地D29分枝杆菌噬菌体。...

【专利技术属性】
技术研发人员：I，
申请(专利权)人：贝尔法斯特女王大学，
类型：发明
国别省市：