检测马铃薯疮痂病致病菌的LAMP检测引物组、试剂和检测方法及应用技术

本发明专利技术提供了检测马铃薯疮痂病致病菌的LAMP检测引物组、试剂和检测方法及应用，涉及农作物病害检测技术领域。本发明专利技术基于常见的马铃薯疮痂病致病菌的16SrDNA和致病毒素合成基因txtAB的保守序列设计筛选出2组环介导等温扩增检测引物，特异性强，准确性高；并且灵敏度高，可达到10pg/μL。本发明专利技术的马铃薯疮痂病致病菌的检测方法，不仅能对菌丝体进行检测，也能对感病马铃薯块茎和带病土壤进行检测，可实现马铃薯疮痂病致病菌的早期检测，即预测土壤中致病菌含量，指导马铃薯种植合理布局，提高种薯生产质量，从种薯切断致病菌来源，预防病害发生。害发生。害发生。

【技术实现步骤摘要】
检测马铃薯疮痂病致病菌的LAMP检测引物组、试剂和检测方法及应用


[0001]本专利技术属于农作物病害检测
，具体涉及检测马铃薯疮痂病致病菌的LAMP检测引物组、试剂和检测方法及应用。

技术介绍

[0002]我国是全球最大的马铃薯生产国，种植面积和产量占世界1/4。马铃薯疮痂病(Potato scab)是由土壤中的植物病原链霉菌(Sterptomyces.spp)引起的土传病害。已报道的引起马铃薯疮痂病的致病链霉菌有二十几种，最常见且研究较为集中的为疮痂链霉菌S.scabies、引起酸性疮痂的S.acidiscabies 和引起凸状疮痂病斑的S.turgidiscabies。虽然马铃薯疮痂病致病菌种类多，分布和组成复杂，但所有致病种产生独有的次生代谢产物Thaxtomins(Thxs) 作为植物毒素，是导致马铃薯疮痂病发生的决定性因素。马铃薯疮痂病通过土壤病原菌积累和带病种薯扩大传播，发生后防治难度较大。因此，建立一种快速、灵敏、直观的检测方法用于土壤中马铃薯疮痂病致病菌的早期预判诊断，指导马铃薯种植合理布局，对病害预测防控具有重要意义。
[0003]目前，分子生物学技术在植物病原菌诊断中应用广泛，常用的PCR检测技术，具有特异性强、灵敏度高等特点，但是存在成本高、需要精密仪器设备、对操作人员专业水平要求高等问题，不易在基层推广使用等问题。

技术实现思路

[0004]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供检测马铃薯疮痂病致病菌的LAMP 检测引物组、试剂和检测方法及应用，方法简便、快速、灵敏、特异性高，可直观观察结果，解决了常规检测和鉴定程序复杂，耗时长、对检测人员专业水平要求高、需要精密仪器设备等问题。
[0005]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0006]本专利技术提供了检测马铃薯疮痂病致病菌的LAMP检测引物组，包括针对马铃薯疮痂病致病菌的16SrDNA的保守序列和/或致病毒素合成基因txtAB 的保守序列设计出的LAMP检测引物组。
[0007]优选的，所述马铃薯疮痂病致病菌包括所有产生致病毒素的疮痂病致病菌。
[0008]优选的，针对所述马铃薯疮痂病致病菌疮痂链霉菌(S.scabiei)、S. acidiscabies和S.turgidiscabies的16SrDNA的保守序列设计出的LAMP检测引物组包括：外引物16S
‑
F3和16S
‑
B3，内引物16S
‑
FIP和16S
‑
BIP，环引物 16S
‑
LF和16S
‑
LB；
[0009]其中16S
‑
F3的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；16S
‑
B3的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；16S
‑
FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；16S
‑
BIP 的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；16S
‑
LF的核苷酸序列如SEQ ID NO.5 所示；16S
‑
LB的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
[0010]优选的，针对所述马铃薯疮痂病致病菌的致病毒素合成基因txtAB的保守序列设
计出的LAMP检测引物组包括：外引物txt
‑
F3和txt
‑
B3，内引物 txt
‑
FIP和txt
‑
BIP；
[0011]其中txt
‑
F3的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；txt
‑
B3的核苷酸序列如 SEQ ID NO.8所示；txt
‑
FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；txt
‑
BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。
[0012]本专利技术还提供了一种检测马铃薯疮痂病致病菌的LAMP检测试剂，包括上述LAMP检测引物组。
[0013]本专利技术还提供了一种检测马铃薯疮痂病致病菌的方法，包括以下步骤：利用上述LAMP检测引物组与待测样品的DNA模板配制LAMP反应体系，于65℃温浴60min，85℃灭活5～10min；
[0014]当扩增结果显示包含16SrDNA的保守序列和/或致病毒素合成基因 txtAB的保守序列，判定为检测阳性。
[0015]优选的，所述LAMP反应体系以25μL计，包括：1.6mmol/L的FIP和 BIP，0.4mmol/L的F3和B3，0.8mmol/L的LF和LB，Bst DNA聚合酶8U， DNA模板50
‑
100ng，12.5μL的环介导等温扩增反应混合液，1μL钙黄绿素染料和余量的无菌超纯水；
[0016]所述LAMP检测引物组中不包含环引物时，配制所述LAMP反应体系时以超纯水补足体积。
[0017]优选的，所述环介导等温扩增反应混合液含40mM Tris
‑
HCl、20mM (NH4)2SO4、20mM KCl、16nM MgSO4、1.6mol/L甜菜碱、2.0mM dNTPs 和0.2％(v/v)Trion X
‑
100。
[0018]优选的，所述扩增结果的分析方法包括显色分析法、扩增曲线分析法和 /或琼脂糖凝胶电泳分析法；
[0019]所述显色分析法包括扩增反应结束后，显色结果观察到绿色荧光判断为阳性，橙色或橘黄色判断为阴性；
[0020]所述扩增曲线分析法包括采用荧光定量绘制实时环介导扩增曲线，在等温扩增的反应时间内出现扩增曲线，则样品为阳性，扩增曲线出现时间越快，致病菌含量浓度越大；
[0021]所述琼脂糖凝胶电泳分析法包括取LAMP扩增产物，用2％琼脂糖凝胶电泳检测，出现梯形条带判断为阳性，没有出现梯形条带则判断为阴性。
[0022]本专利技术还提供了上述LAMP检测引物组或上述LAMP检测试剂在土壤病原菌含量的早期诊断、监测和病原菌鉴定中的应用。
[0023]有益效果：本专利技术提供了检测马铃薯疮痂病致病菌的LAMP检测引物组，基于常见的马铃薯疮痂病致病菌的16SrDNA和致病毒素合成基因txtAB 的保守序列设计筛选出2组环介导等温扩增检测引物，特异性强，准确性高。本专利技术实施例中对不同地理来源的3种马铃薯疮痂致病菌(S.scabiei G9、S.galilaeus GBH2、S.enissocaesilis SYNT3)、马铃薯疮痂病发病块茎、发病地块土壤、马铃薯青枯病菌茄科雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)、马铃薯枯萎病菌尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum)、马铃薯黑痣病立枯丝核菌 (Rhizoctonia solani)的DNA进行检测，只有3种马铃薯疮痂致病菌、马铃薯疮痂病发病块茎、发病地块土壤样本呈现阳性，说明本专利技术所设计的引物及检测方法用于检测马铃薯疮痂本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.检测马铃薯疮痂病致病菌的LAMP检测引物组，其特征在于，包括针对马铃薯疮痂病致病菌的16SrDNA的保守序列和/或致病毒素合成基因txtAB的保守序列设计出的LAMP检测引物组。2.根据权利要求1所述LAMP检测引物组，其特征在于，所述马铃薯疮痂病致病菌包括所有产生致病毒素的疮痂病致病菌。3.根据权利要求1或2所述LAMP检测引物组，其特征在于，针对所述马铃薯疮痂病致病菌疮痂链霉菌(S.scabiei)、S.acidiscabies和S.turgidiscabies的16SrDNA的保守序列设计出的LAMP检测引物组包括：外引物16S
‑
F3和16S
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B3，内引物16S
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FIP和16S
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BIP，环引物16S
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LF和16S
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LB；其中16S
‑
F3的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；16S
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B3的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；16S
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FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；16S
‑
BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；16S
‑
LF的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；16S
‑
LB的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。4.根据权利要求1或2所述LAMP检测引物组，其特征在于，针对所述马铃薯疮痂病致病菌的致病毒素合成基因txtAB的保守序列设计出的LAMP检测引物组包括：外引物txt
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F3和txt
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B3，内引物txt
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FIP和txt
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BIP；其中txt
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F3的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；txt
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B3的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；txt
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FIP的核苷酸序列如SEQ ID N...

【专利技术属性】
技术研发人员：聂峰杰，巩檑，张丽，刘璇，杨文静，李新，张茜，甘晓燕，石磊，
申请(专利权)人：宁夏农林科学院农业生物技术研究中心宁夏农业生物技术重点实验室，
类型：发明
国别省市：