沙门氏菌的可视化检测试剂盒制造技术

本发明专利技术提供沙门氏菌的可视化检测试剂盒，包括：标准结果对照品、阳性标准品、阴性标准品、核酸提取管、核酸检测管、检测液I、检测液II、检测液III；本发明专利技术在核酸提取过程和核酸扩增过程不需要昂贵的仪器设备，检测特异性强，灵敏度是PCR检测10

【技术实现步骤摘要】
沙门氏菌的可视化检测试剂盒


[0001]本专利技术涉及一种腹泻性病原菌的提取检测试剂盒，特别是涉及一种沙门氏菌的检测试剂盒。

技术介绍

[0002]现行的国家标准GB4789，其方法是先对样本增菌，然后用平板法进行多次筛选及生化试验鉴别，传统细菌检测法分析时间通常需要2～3d，操作繁琐成本高且周期很长，限制了在基层实验室和现场的应用。
[0003]目前对沙门氏菌的分子生物学的检测方法有很多种，检测沙门氏菌的常用方法包括传统的PCR检测、荧光PCR、LAMP法检测、微流控传感器检测法等。这些方法使用较广泛，PCR法虽然缩短检测周期，特异性、敏感性都很好，但样本预处理时间长，易被污染，容易出现假阴性、假阳性结果；而且检测周期依然在120min左右，更需要依赖昂贵的仪器设备。

技术实现思路

[0004]鉴于以上所述现有技术的缺点，本专利技术根据沙门氏菌的invA基因保守序列，设计RPA检测方法，结合可视化的核酸染色液，建立可视化检测方法，并检测其特异性和敏感性，本研究建立的方法综合一步核酸提取试剂，满足快速检测沙门氏菌，不需要复杂的仪器设备且操作简单、灵敏度高，可以在基层实验室或现场环境等使用，适合推广。
[0005]为实现上述目的及其他相关目的，本专利技术提供沙门氏菌的可视化检测试剂盒包括：标准结果对照品、阳性标准品、阴性标准品、核酸提取管、核酸检测管、检测液I、检测液II、检测液III；所述核酸提取管为包含100μL
‑
500μL的核酸提取试剂的无菌EP管；所述标准结果对照品为可密封的PCR 8联排管中，其中5管装有不同颜色液体；所述阳性标准品为含有沙门氏菌标准菌株基因组DNA的溶液，其中的DNA浓度为10
‑2ng/μL
‑
100ng/μL，优选1ng/μL；所述阴性标准品为不含有核酸的无菌去离子水；所述核酸检测管为包含RPA通用反应试剂冻干制剂的带盖PCR反应管；所述检测液I为含有沙门氏菌检测上游引物F2和沙门氏菌检测下游引物R2的RPA通用反应检测液，所述检测液I中含有沙门氏菌检测上游引物F2浓度为0.28μM
‑
0.85μM；所述沙门氏菌检测下游引物R2浓度为0.28μM
‑
0.85μM；所述检测液II为醋酸镁的溶液；其中醋酸镁浓度为280mM；所述检测液III为浓度在100
×‑
10000
×
之间的SYBR Green I溶液。
[0006]优选地，所述标准结果对照品获取方法为：按照本专利技术检测待测样本中的沙门氏菌的步骤检测沙门氏菌基因组DNA浓度为10
‑3ng/μL、10
‑4ng/μL、10
‑5ng/μL的三个样本以及阴性标准品、阳性标准品，检测完成后得到5个带颜色的核酸检测管，参照上述核酸检测管结果颜色，用橙色和绿色染料配制5份颜色与之对应一致的染色液，依次按顺序将5份配制的染色液加入可密封的PCR 8联排管的5个管中，盖上8联排盖子，在盖子或8联排管的外侧依次标注为10
‑3ng/μL、10
‑4ng/μL、10
‑5ng/μL、0、+，整体作为标准结果对照品；所述标准结果对照品中的液体容量为50μL
‑
200μL，优选为50μL；所述5个带颜色的核酸检测管结果颜色依
次分别为绿色、黄绿色、浅黄绿色、橙红色、绿色；所述本专利技术检测待测样本中的沙门氏菌的步骤为：(1)待测样本核酸提取；(2)配制本专利技术的待测样本的检测体系：33.5μL检测液I加入到核酸检测管；加入12μL待测核酸；2.5μL检测液II加入到核酸检测管；将2μL的检测液III滴加在核酸检测管的盖子内侧上；(3)盖上核酸检测管盖子，将核酸检测管放置35℃
‑
45℃中反应5min
‑
25min；(4)结果检测：将核酸检测管上下颠倒，充分混匀核酸检测管中液体；核酸检测管在室温放置1min
‑
5min；每次检测反应均同步检测阳性标准品、阴性标准品各一份；(5)结果判读：首先检测阳性标准品的核酸检测管，比对标准结果对照品，与标准结果对照品中标注为“+”的管的颜色一致为绿色，且检测阴性标准品的核酸检测管比对标准结果对照品，与标准结果对照品中标注为“0”的管的颜色一致为橙红色，判断本次检测结果可信，否则结果不可信，需要重新检测；检测待测样本的核酸检测管比对标准结果对照品，颜色为橙红色且与标注为“0”的管的颜色一致，判断为阴性；检测待测样本的核酸检测管颜色为绿色且与标准结果对照品中标注为“+”的管的颜色相近，判断为阳性，同时判断待测核酸浓度大于10
‑3ng/μL；检测待测样本的核酸检测管颜色与标注为“10
‑4ng/μL”的管的颜色相近，判断为待测核酸浓度接近10
‑4ng/μL；检测待测样本的核酸检测管颜色与标准结果对照品中标注为“10
‑5ng/μL”的管的颜色相近判断待测核酸浓度接近10
‑5ng/μL；所述步骤(1)待测样本核酸提取的具体操作为：1)待测样本为液体时每份样本取100μL
‑
500μL，待测样本为胶状或膏状或半固体状或固体时，每份待测样本取100mg
‑
500mg，充分剪碎；2)所述待测样本加入核酸提取管，充分混匀；3)核酸提取管放置90℃
‑
100℃孵育5min
‑
25min；4)将核酸提取管12000g离心，1min
‑
5min，保留上清液，上清液即为提取得到的待测核酸。
[0007]优选地，所述本专利技术的待测样本核酸提取步骤的1)中，优选的，所述待测样本的取样量与核酸提取管内的核酸提取试剂的用量相同；更优选的，所述核酸提取管中装有200μL的核酸提取试剂；更优选的，所述待测样本为液体时每份样本取200μL，待测样本为胶状或膏状或半固体状或固体时，每份待测样本取200mg。
[0008]优选地，所述待测样本核酸提取步骤3)中，更优选的，100℃孵育10min；待测样本核酸提取步骤4)中，更优选的，12000g离心3min。
[0009]优选地，所述本专利技术检测待测样本中的沙门氏菌的步骤(3)中更优选的温度为35℃；其中，优选的反应时间为5min
‑
20min。
[0010]优选地，所述本专利技术检测待测样本中的沙门氏菌的步骤(3)更优选的反应时间为10min。
[0011]优选地，所述阳性标准品获取方法：按照通用细菌基因组DNA提取试剂盒操作提取沙门氏菌标准菌株基因组DNA，从细菌样本中获得DNA，溶于TE溶液或无菌去离子水中，检测核酸浓度后，用TE溶液或无菌去离子水稀释沙门氏菌标准菌株基因组DNA浓度为10
‑2ng/μL
‑
100ng/μL，更优选的稀释沙门氏菌标准菌株基因组DNA浓度为1ng/μL。
[0012]优选地，所述核酸提取管中核酸提取试剂为：0.5mol/LNaOH本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.沙门氏菌的可视化检测试剂盒，其特征在于，所述沙门氏菌的可视化检测试剂盒包括：标准结果对照品、阳性标准品、阴性标准品、核酸提取管、核酸检测管、检测液I、检测液II、检测液III；所述核酸提取管为包含100μL
‑
500μL的核酸提取试剂的无菌EP管；所述标准结果对照品为可密封的PCR 8联排管中，其中5管装有不同颜色液体；所述阳性标准品为含有沙门氏菌标准菌株基因组DNA的溶液，其中的DNA浓度为10
‑2ng/μL
‑
100ng/μL，优选1ng/μL；所述阴性标准品为不含有核酸的无菌去离子水；所述核酸检测管为包含RPA通用反应试剂冻干制剂的带盖PCR反应管；所述检测液I为含有沙门氏菌检测上游引物F2和沙门氏菌检测下游引物R2的RPA通用反应检测液，所述检测液I中含有沙门氏菌检测上游引物F2浓度为0.28μM
‑
0.85μM；所述沙门氏菌检测下游引物R2浓度为0.28μM
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0.85μM；所述检测液II为醋酸镁的溶液；其中醋酸镁浓度为280mM；所述检测液III为浓度在100
×‑
10000
×
之间的SYBR Green I溶液。2.根据权利要求1所述的沙门氏菌的可视化检测试剂盒，其特征在于：所述标准结果对照品获取方法为：按照本发明检测待测样本中的沙门氏菌的步骤检测沙门氏菌基因组DNA浓度为10
‑3ng/μL、10
‑4ng/μL、10
‑5ng/μL的三个样本以及阴性标准品、阳性标准品，检测完成后得到5个带颜色的核酸检测管，参照上述核酸检测管结果颜色，用橙色和绿色染料配制5份颜色与之对应一致的染色液，依次按顺序将5份配制的染色液加入可密封的PCR 8联排管的5个管中，盖上8联排盖子，在盖子或8联排管的外侧依次标注为10
‑3ng/μL、10
‑4ng/μL、10
‑5ng/μL、0、+，整体作为标准结果对照品；所述标准结果对照品中的液体容量为50μL
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200μL，优选为50μL；所述5个带颜色的核酸检测管结果颜色依次分别为绿色、黄绿色、浅黄绿色、橙红色、绿色；所述本发明检测待测样本中的沙门氏菌的步骤为：(1)待测样本核酸提取；(2)配制本发明的待测样本的检测体系：33.5μL检测液I加入到核酸检测管；加入12μL待测核酸；2.5μL检测液II加入到核酸检测管；将2μL的检测液III滴加在核酸检测管的盖子内侧上；(3)盖上核酸检测管盖子，将核酸检测管放置35℃
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45℃中反应5min
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25min；(4)结果检测：将核酸检测管上下颠倒，充分混匀核酸检测管中液体；核酸检测管在室温放置1min
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5min；每次检测反应均同步检测阳性标准品、阴性标准品各一份；(5)结果判读：首先检测阳性标准品的核酸检测管，比对标准结果对照品，与标准结果对照品中标注为“+”的管的颜色一致为绿色，且检测阴性标准品的核酸检测管比对标准结果对照品，与标准结果对照品中标注为“0”的管的颜色一致为橙红色，判断本次检测结果可信，否则结果不可信，需要重新检测；检测待测样本的核酸检测管比对标准结果对照品，颜色与标注为“0”的管的颜色一致，判断为阴性；检测待测样本的核酸检测管颜色与标准结果对照品中标注为“+”的管的颜色相近，判断为阳性，同时判断待测核酸浓度大于10
‑3ng/μL；检测待测样本的核酸检测管颜色与标准结果对照品中标注为“10
‑4ng/μL”的管的颜色相近，判断...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐颖，王岩，闫吉辉，陈晓光，刘海江，张瑾，梁洁，侯伟，张娟，徐翮，滕新栋，
申请(专利权)人：青岛国际旅行卫生保健中心青岛海关口岸门诊部，
类型：发明
国别省市：