制备用于CRISPR的个性化的靶标不相关的向导RNA池的方法技术

本发明专利技术涉及使用用于sgRNA引导的核酸结合蛋白的合成单链向导RNA(sgRNA)获得靶标多核苷酸的富集的个性化群体的方法，并且涉及获得用于sgRNA引导的核酸结合蛋白的个性化的靶标不相关的合成单链向导RNA(sgRNA)的池的方法。还提供了包含通过本发明专利技术的方法可获得的sgRNA的池的试剂盒，通过本发明专利技术的方法可获得的sgRNA的池的应用以及监测疾病状况的方法。sgRNA的池的应用以及监测疾病状况的方法。sgRNA的池的应用以及监测疾病状况的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】制备用于CRISPR的个性化的靶标不相关的向导RNA池的方法


[0001]本专利技术涉及使用用于sgRNA引导的核酸结合蛋白的合成单链向导RNA(sgRNA)获得靶标多核苷酸的富集的个性化群体的方法，并且涉及获得用于sgRNA引导的核酸结合蛋白的个性化的靶标不相关的合成单链向导RNA(sgRNA)的池的方法。还提供了包含通过本专利技术的方法可获得的sgRNA的池的试剂盒，通过本专利技术的方法可获得的sgRNA的池的应用以及监测疾病状况的方法。

技术介绍

[0002]下一代测序(NGS)是包括尤其在癌症医学领域中的现代诊断在内的遗传学和分子研究的主要驱动力。该技术为研究DNA或RNA样品提供了强有力的方法。已开发出新的和改进的方法和规程以支持各种应用，包括遗传变异和样品特异性差异的分析。为了改进这种方法，已开发出了旨在通过聚焦于特定序列、转录本、基因或基因组子区域或通过消除不需要的序列来靶向富集测序文库的方法。
[0003]靶向富集在一些情况下可以是有用的，例如，需要分析整个基因组的特定部分的情况。完整外显子组(所有转录序列)的有效测序是此方法的典型实例。其他实例包括特定转录本的富集，突变热点的富集或干扰核酸物质的排除。具体地，在个性化序列确定或基于患者的分子监测的背景中，这些靶向富集策略是重要的，其中(i)将分析和监测患者的转录组文库和(ii)文库中仅序列亚组具有诊断相关性。
[0004]当前用于靶向富集的技术包括(i)杂交捕获，其中来源于输入样品的核酸链在溶液中或在固体载体上和与所关心的靶标区互补的预先制备的DNA片段特异性杂交，从而可以物理捕获并分离所关心的序列；(ii)选择性环化或分子反转探针(MIP)，其中通过间隙填充和连接化学以高度特异性方式形成了包括靶标区序列的单链DNA环，从而产生了具有常见DNA元件的结构，然后将其用于选择性扩增所关心的靶标区；和(iii)聚合酶链反应(PCR)扩增，其中通过并行进行多重长距离PCR、有限数量的标准多重PCR或扩增非常大数量短片段的高度多重PCR方法，将PCR导向所关心的靶标区(Mertes等人,2011,Briefings in functional Genomics,10,6,374
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386)。
[0005]最近，将CRISPR/Cas技术用于靶向富集目的，具体地为了从测序文库中去除不需要的序列。
[0006]CRISPR/Cas技术是基于CRISPR/Cas(成簇的规律间隔的短回文重复序列/Cas)细菌免疫系统的重新调整用途的(repurposing)新的并且非常通用的基因组编辑和表观基因组编辑工具(Cong等人,2013,Science,339,819
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824)。当与被称为单链向导RNA(sgRNA)的短RNA寡核苷酸复合时，Cas核酸酶可以在特异性sgRNA互补位置引起双链断裂(DSB)。
[0007]CRISPR/Cas系统还被重新用作可编程的限制性内切酶以非常精确和定制的方式指导切割(Lee等人,2015,Nucleic Acids Res.,43,1
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9)。
[0008]因此，已开发出使用CRISPR/Cas的方法，该方法在称为通过杂交耗尽丰富序列(DASH)的过程中选择性耗尽过剩序列。DASH用于通过指导靶标的靶向切割并阻止靶标的进
一步扩增和测序去除靶标，如从mRNA
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seq中去除核糖体RNA(rRNA)和从癌症样品中去除野生型KRAS背景序列(Gu等人,2016.Genome Biol.,17,41)。根据Gu等人，在转座子介导的片段化之后但在随后的扩增步骤(这取决于片段两端是否存在衔接子序列)之前使用DASH能够防止靶标序列(线粒体rRNA)的扩增，从而确保它们不出现在最终测序文库中。
[0009]然而，这种富集方法适合于仅从测序文库中去除特定物质，而所有其他序列仍保留在文库中。因此，需要一种通用的个性化转录组
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基富集和分析方法，其使得能够有效降低测序文库的复杂性，并由此涉及降低的测序深度和易管理的要处理的数据量并由此使得能够(例如)在监测方法中反复实施。

技术实现思路

[0010]本专利技术解决了这种需要并且提供了获得靶标多核苷酸的富集的个性化群体的方法，所述方法包括：(i)从获自受试者的样品纯化mRNA分子的群体；(ii)从步骤(i)的mRNA分子制备cDNA；(iii)从步骤(ii)中获得的cDNA扩增一条或多条靶标序列以获得DNA分子的池；(iv)使所扩增的DNA分子片段化，优选地片段化至20至30bp的尺寸；(v)将步骤(iv)的片段连接至能够结合至同源相互作用子的标签以获得标签化捕手寡核苷酸的池；(vi)提供用于制备用于sgRNA引导的核酸结合蛋白的合成单链向导RNA(sgRNA)的池的起始寡核苷酸的池，其中所述起始寡核苷酸包括启动子节段、作为捕手寡核苷酸的潜在互补序列的随机节段和结合节段，其与用于与所述用于sgRNA引导的核酸结合蛋白相互作用的支架序列的至少一部分互补；(vii)使所述起始寡核苷酸的池与所述标签化的捕手寡核苷酸杂交；(viii)通过将所述标签结合至同源相互作用子(优选地位于磁珠或适合的表面上)，从所述起始寡核苷酸的池除去起始寡核苷酸和标签化的捕手寡核苷酸的复合物，借此获得减少的起始寡核苷酸的池；(ix)用步骤(viii)中所获得的所述减少的起始寡核苷酸的池制备sgRNA的池；(x)使用步骤(ix)中获得的sgRNA的池，通过用于sgRNA引导的核酸结合蛋白切割获自测试样品的多核苷酸的混合物；和(xi)从步骤(x)中获得的所述多核苷酸的混合物尺寸选择一条或多条未切的靶标多核苷酸。通过提供能够结合至所述序列的sgRNA池，所述方法有利地允许除去相对于个性化的靶标多核苷酸靶标不相关的全部序列，即患者转录组的基因或基因组(panel of genes)。由此，极大降低了所产生的个性化测序文库的复杂性，并且对该文库执行测序操作，具体地下一代测序(NGS)包括低得多的测序深度，这显著降低了测序成本以及后续数据管理和数据处理的成本。
[0011]在另一个方面，本专利技术涉及获得用于sgRNA引导的核酸结合蛋白的个性化的靶标不相关的合成单链向导RNA(sgRNA)的池的方法，所述方法包括：(i)从获自受试者的样品纯化mRNA分子的群体；(ii)从步骤(i)的mRNA分子制备cDNA；(iii)从步骤(ii)中获得的cDNA扩增一条或多条靶标序列以获得DNA分子的池；(iv)使所扩增的DNA分子片段化，优选地片段化至20至30bp的尺寸；(v)将步骤(iv)的片段连接至能够结合至同源相互作用子的标签以获得标签化捕手寡核苷酸的池；(vi)提供用于制备用于sgRNA引导的核酸结合蛋白的合成单链向导RNA(sgRNA)的池的起始寡核苷酸的池，其中所述起始寡核苷酸包括启动子节段、作为捕手寡核苷酸的潜在互补序列的随机节段和结合节段，其与用于与所述用于sgRNA引导的核酸结合蛋白相互作用的支架序列的至少一部分互补本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.获得靶标多核苷酸的富集的群体的方法，所述方法包括：(i)从获自受试者的样品纯化mRNA分子的群体；(ii)从步骤(i)的所述mRNA分子制备cDNA；(iii)从步骤(ii)中获得的所述cDNA扩增一条或多条靶标序列以获得DNA分子的池；(iv)使所述扩增的DNA分子片段化，优选地片段化至20至30bp的尺寸；(v)将步骤(iv)的所述片段连接至能够结合至同源相互作用子的标签以获得标签化的捕手寡核苷酸的池；(vi)提供用于制备用于sgRNA引导的核酸结合蛋白的合成单链向导RNA(sgRNA)的池的起始寡核苷酸的池，其中所述起始寡核苷酸包括启动子节段、作为捕手寡核苷酸的潜在互补序列的随机节段和结合节段，其与用于与所述用于sgRNA引导的核酸结合蛋白相互作用的支架序列的至少一部分互补；(vii)使所述起始寡核苷酸的池与所述标签化的捕手寡核苷酸杂交；(viii)通过将所述标签结合至同源相互作用子，优选地位于磁珠或适合的表面上，从所述起始寡核苷酸的池除去起始寡核苷酸和标签化的捕手寡核苷酸的复合物，借此获得减少的起始寡核苷酸的池；(ix)用步骤(viii)中所获得的所述减少的起始寡核苷酸的池制备sgRNA的池；(x)使用步骤(ix)中获得的所述sgRNA的池，通过用于sgRNA引导的核酸结合蛋白切割获自测试样品的多核苷酸的混合物；和(xi)从步骤(x)中获得的所述多核苷酸的混合物尺寸选择一条或多条未切的靶标多核苷酸。2.获得用于sgRNA引导的核酸结合蛋白的个性化的靶标不相关的合成单链向导RNA(sgRNA)的池的方法，所述方法包括：(i)从获自受试者的样品纯化mRNA分子的群体；(ii)从步骤(i)的所述mRNA分子制备cDNA；(iii)从步骤(ii)中获得的所述cDNA扩增一条或多条靶标序列以获得DNA分子的池；(iv)使所述扩增的DNA分子片段化，优选地片段化至20至30bp的尺寸；(v)将步骤(iv)的所述片段连接至能够结合至同源相互作用子的标签以获得标签化的捕手寡核苷酸的池；(vi)提供用于制备用于sgRNA引导的核酸结合蛋白的合成单链向导RNA(sgRNA)的池的起始寡核苷酸的池，其中所述起始寡核苷酸包括启动子节段、作为捕手寡核苷酸的潜在互补序列的随机节段和结合节段，其与用于与所述用于sgRNA引导的核酸结合蛋白相互作用的支架序列的至少一部分互补；(vii)使所述起始...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄意巍，
申请(专利权)人：西门子医疗有限公司，
类型：发明
国别省市：