放线菌核酸提取检测试剂、试剂盒及其方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种放线菌核酸提取检测试剂、试剂盒及其方法和应用，所述提取检测试剂含有InstaGeneMatrix、Tris

【技术实现步骤摘要】
放线菌核酸提取检测试剂、试剂盒及其方法和应用


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及放线菌核酸的提取与检测


技术介绍

[0002]结核病(TB，tuberculosis)是一种由分支杆菌属分枝杆菌复合群(Mycobacterium tuberculosis complex,MTBC)引起的慢性细菌性疾病，结核分枝杆菌属于典型放线菌，结核病常见于肺部，也可以在其他组织中发现。该病可以通过病患个体咳嗽、打喷嚏或者吐痰而将MTBC传播到空气中，造成结核病在人与人之间的传播，并且该传染可以侵犯人体全身多个脏器。据统计，全球人口约有三分之一被MTBC感染，并且每年确证的病例多达1000万，死亡人数高达150万。在我国，TB是继乙肝后的第二大甲乙类传染病。更为糟糕的是MTBC的耐药菌株正在增加，尤其是在发展中国家中。因此，如何对结核分枝杆菌进行精准鉴定以及其后的治疗成为亟待解决的问题。以往在固体或液体培养基上培养被视为用于检测结核分枝杆菌的黄金标准，但是培养时间占用长达八周才能得到结果，严重影响对病患进行及时有效的救治，从而延误最佳治疗时机。
[0003]近年来随着分子生物学和生物技术的发展，基于核酸扩增的检测技术不断涌现，如实时定量PCR(Real
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time polymerase chain reaction,RT
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PCR)、环介导等温扩增技术以及宏基因组测序(metagenomic next
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generation sequencing，mNGS)，均具有快速、灵敏的特点，已被广泛使用以确定临床样本中结核分枝杆菌的存在。而纵观结核病病原本身，其之所以难以被检测，是因为它的相对含量较少，而且是胞内病原菌，难以破壁。
[0004]为了解决这一问题，诸多生物技术公司如德国凯杰以及国内的天根生化、美基生物等纷纷专注研发核酸提取相关技术并将其转化为核酸提取试剂盒产品。目前已有的核酸提取技术主要采用特殊硅基质材料在一定的高盐、低pH值情况下高效、专一地吸附核酸，在低盐、高pH值情况下释放核酸。搭配含有合成树脂的离心柱，使用常规台式高速离心机在几分钟内即可高效回收核酸片段。除此之外，磁珠纯化方法也被广泛应用于核酸提取以及纯化等领域。其原理是基于一种固相载体可逆化固定的分离纯化方法。磁珠体系中一般包含有磁珠、DNA、聚乙二醇(PEG)以及盐离子等，在一定浓度的PEG和盐离子环境中，DNA可吸附到羧基修饰的高分子磁珠表面，该过程是可逆的，在适当条件下，结合的DNA分子可以被洗脱回收。
[0005]然而，以上两种核酸提取技术步骤繁杂，尤其是前处理步骤涉及到多次液相转移和加溶液过程，使得整个流程的操作时间较长。不仅容易造成交叉污染，而且在成本上都较高，使得大规模广泛应用的成本居高不下。

技术实现思路

[0006]针对上述内容中所记载的技术问题中的一种，本专利技术提出了一种放线菌核酸提取检测试剂、试剂盒及其方法和应用，改善了当前结核分枝杆菌核酸提取与检测的窘境，采用“一管到底”的操作，缩减了样本和溶液的转移过程，使操作时间缩短一倍以上。同时由于操
作步骤的减少，交叉污染的可能性亦大幅降低。在成本控制上，该方法相较于前两种方法大大降低了使用成本，相较于柱法和磁珠法分别降低了二百倍和五十倍。最后在提取结核分枝杆菌的性能上，本专利技术方法从模拟样本和临床样本中均可以提取到结核分枝杆菌的核酸，检测限可低于8拷贝/ml，优于目前市场上绝大多数MTBC检测平台。
[0007]第一方面，本专利技术提供了一种放线菌核酸提取检测试剂盒，包括提取检测试剂，所述提取检测试剂含有质量浓度为1％
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5％的InstaGene Matrix；pH为8.0，物质的量浓度为10mmol/L
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100mmol/L的Tris
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HCl；质量浓度为1％
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20％的SDS；物质的量浓度为10mmol/L
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100mmol/L的KCl；物质的量浓度为1mmol/L
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10mmol/L的EDTA。
[0008]第二方面，本专利技术提供了放线菌核酸提取检测试剂盒在放线菌核酸提取检测中的应用。
[0009]具体的，本专利技术提供了放线菌核酸提取检测试剂盒在结核分枝杆菌核酸提取检测中的应用。
[0010]第三方面，本专利技术的放线菌核酸提取检测试剂盒在结核分枝杆菌核酸提取检测中的应用时，所采用的引物序列信息为：IS6110
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F：GGTCAGCACGATTCGGAGTGG；IS6110
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R：ACTCGACACCCCACCGCAAAC。
[0011]更进一步本专利技术提取检测采用的引物序列信息还包括rpoB
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F:GGTGGAAACCGACGACATC；rpoB
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R:GTACGGCGTTTCGATGAACC，采用这部分引物不但可以检测出结核分枝杆菌，还能进一步明确耐药结核分枝杆菌的情况。
[0012]第四方面，本专利技术还提供了一种结核分枝杆菌核酸的提取限的确定方法，包括如下步骤：
[0013](1)设置多种不同微生物的组合并添加人源背景，结核分枝杆菌的投入参数为8～25000拷贝数/ml；
[0014](2)核酸提取：将配置好的1ml混合菌液离心沉淀，参数为10000
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14000rpm，1分钟，移除上清；加入200μl核酸提取液到菌落沉淀，震荡混匀；之后将混合物置于100℃水浴中，放置5
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10分钟，之后室温冷却1
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3分钟；将裂解产物高速离心沉淀，参数为10000
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14000rpm，2分钟；取上清50
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150μl，优选100μl用于后续的质量控制与目标基因检测；
[0015](3)进行浓度测定与质控：用NanoReady对提取到的核酸溶液进行质量控制，参数为A260/A280、A260/A230；同时采用Agilent 2100对提取到的核酸进行质控；
[0016](4)对照方法组提取：依据柱法提取进行；
[0017](5)提取结果比对：比较的参数包括提取时间，提取成本，提取核酸质量控制，提取总量，PCR扩增检测结果；
[0018]PCR扩增检测采用的结核分枝杆菌鉴定基因引物IS6110
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F：GGTCAGCACGATTCGGAGTGG；IS6110
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R：ACTCGACACCCCACCGCAAAC；采用的结核分枝杆菌耐药基因引物rpoB
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F:GGTGGAAACCGACGACATC；rpoB
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R:GTACGGCGTTTCGATGAACC；
[0019]所述PCR扩增采用普通PCR mix试剂盒；
[0020]PCR检测与验证：对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析和后续的二代测序分析；<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种放线菌核酸提取检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括提取检测试剂，所述提取检测试剂由质量浓度为1％
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5％的InstaGene Matrix、pH为8.0，物质的量浓度为10mmol/L
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100mmol/L的Tris
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HCl、质量浓度为1％
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20％的SDS、物质的量浓度为10mmol/L
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100mmol/L的KCl、物质的量浓度为1mmol/L
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10mmol/L的EDTA五种物质组成。2.权利要求1所述的放线菌核酸提取检测试剂盒在放线菌核酸提取检测中的应用。3.权利要求2所述的放线菌核酸提取检测试剂盒在结核分枝杆菌核酸提取检测中的应用。4.权利要求3所述的放线菌核酸提取检测试剂盒在结核分枝杆菌核酸提取检测中的应用，其特征在于，所述提取检测采用的引物序列信息为：IS6110
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F：GGTCAGCACGATTCGGAGTGG；IS6110
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R：ACTCGACACCCCACCGCAAAC。5.权利要求4所述的放线菌核酸提取检测试剂盒在结核分枝杆菌核酸提取检测中的应用，其特征在于，所述提取检测采用的引物序列信息还包括rpoB
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F:GGTGGAAACCGACGACATC；rpoB
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R:GTACGGCGTTTCGATGAACC。6.一种结核分枝杆菌核酸的提取限的确定方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)设置多种不同微生物的组合并添加人源背景，结核分枝杆菌的投入参数为8～25000拷贝数/ml；(2)核酸提取：将配置好的1ml混合菌液离心沉淀，参数为10000
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14000rpm，1分钟，移除上清；加入200μl核酸提取液到菌落沉淀，震荡混匀；之后将混合物置于100℃水浴中，放置5
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10分钟，之后室温冷却1
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3分钟；将裂解产物高速离心沉淀，参数为10000
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14000rpm，2分钟；取上清50
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150μl，用于后续的质量控制与目标基因检测；(3)进行浓度测定与质控：用NanoReady对提取到的核酸溶液进行质量控制，参数为A260/A280、A260/A230；同时采用Agilent 2100对提取到的核酸进行质控；(4)对照方法组提取：依据柱法提取进行；(5)提取结果比对：比较的参数包括提取时间，提取成本，提取核酸质量控制，提取总量，PCR扩增检测结果；PCR扩增...

【专利技术属性】
技术研发人员：夏涵，官远林，付健，尚芳娟，王鹏军，杨书恒，李长诚，佟斯垚，
申请(专利权)人：西咸新区予果微码生物科技有限公司予果智造科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：