一种等温核酸检测酶组合物、试剂盒及其用途和检测方法技术

本发明专利技术涉及核酸检测领域，具体涉及一种等温核酸检测酶组合物、试剂盒及其用途和检测方法。本发明专利技术提供的一种等温核酸检测的酶组合物，包括重组酶、单链结合蛋白、DNA聚合酶、重组酶辅助蛋白、T7RNA聚合酶和Cas13a蛋白；利用所述酶进行等温核酸检测时，无需对扩增产物进行单链化处理，实现对目的片段的一步法扩增及检测。测。测。

【技术实现步骤摘要】
一种等温核酸检测酶组合物、试剂盒及其用途和检测方法


[0001]本专利技术涉及核酸检测领域，具体涉及一种等温核酸检测酶组合物、试剂盒及其用途和检测方法。

技术介绍

[0002]CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)是细菌和古细菌种抵御病毒入侵的一种获得性免疫的方式。当病毒入侵时，细菌或古细菌生成对应的能识别病毒基因组的crRNA，可以引导具有核酸内切酶活性的Cas蛋白对病毒靶序列进行识别和切割。CRISPR
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Cas13是基于细菌免疫系统的RNA靶向和编辑系统，可保护其免受病毒侵袭。该系统类似于CRISPR
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Cas9系统，但与靶向DNA的Cas9不同，Cas13蛋白仅靶向切割单链RNA。Cas13a(又叫C2c2)最初是2015年被成功鉴定出来，是CRISPR
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Cas系统中的第二大类第VI型，是家族中目前发现的唯一只靶向ssRNA的系统。它的结合和切割的对象为RNA。
[0003]从结构上本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于等温核酸检测的酶组合物，其特征在于，包括重组酶、单链结合蛋白、DNA聚合酶、重组酶辅助蛋白、T7 RNA聚合酶和Cas13a蛋白。2.根据权利要求1所述的用于等温核酸检测的酶组合物，其特征在于，所述重组酶包括UvsX蛋白；可选的，所述UvsX蛋白包括T4 UvsX蛋白、T6 UvsX蛋白或Rb69 UvsX蛋白；或所述重组酶辅助蛋白包括UvsY蛋白；可选的，所述UvsY蛋白包括T4 UvsY蛋白、T6 UvsY蛋白或Rb69 UvsY蛋白；或所述单链结合蛋白包括GP32蛋白；可选的，所述GP32蛋白包括T4GP32蛋白、T6 GP32蛋白或Rb69 GP32蛋白；或所述DNA聚合酶包括链置换DNA聚合酶；可选的，所述链置换DNA聚合酶包括金黄色葡萄球菌的DNA聚合酶I的大片段、枯草芽孢杆菌DNA聚合酶I大片段或大肠杆菌DNA聚合酶I大片段；或所述Cas13a蛋白为韦德纤毛菌来源的LwCas13a蛋白。3.根据权利要求2所述的用于等温核酸检测的酶组合物，其特征在于，所述UvsX蛋白为如下A1)
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A2)中任意一种：A1)氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示；A2)如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列的任意一个或几个氨基酸残基经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的氨基酸序列具有90％以上的同一性的蛋白；和/或，所述UvsY蛋白为如下B1)
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B2)中任意一种：B1)氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示；B2)如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列的任意一个或几个氨基酸残基经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与B1)所示的蛋白具有90％以上的同一性的蛋白；和/或，单链结合蛋白GP32为如下C1)
‑
C2)中任意一种：C1)氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示；C2)如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列的任意一个或几个氨基酸残基经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与C1)所示的蛋白具有90％以上的同一性的蛋白；和/或，所述Cas13a蛋白为如下D1)
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D2)中任意一种：D1)氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示；D2)如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列的任意一个或几个氨基酸残基经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与D1)所示的蛋白具有90％以上的同一性的蛋白。4.根据权利要求1
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3任一项所述的用于等温核酸检测的酶组合物，其特征在于，所述酶组合物中，重组酶、重组酶辅助蛋白、单链结合蛋白、DNA聚合酶和Cas13a蛋白的质量比为1：(0.2
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4.6)：(0.77
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2.3)：(0.2
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1)：(0.1
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1.2)；T7 RNA聚合酶在使用时的终浓度为0.2
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1U/μ
L。可选的，所述酶组合物为液态混合物或冻干粉混合物。5.一种等温核酸检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1
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4任一项所述的用于等温核酸检测的酶组合物；可选的，还包括扩增缓冲液、报告分子和反应启动剂中的至少一种；可选的，所述等温核酸检测试剂盒中，分为独立包装的三部分，第一部分为包括酶组合物、扩增缓冲液和报告分子的冻干粉，第二部分为反应缓冲液，第三部分为反应启动剂；所述反应缓冲液中含有缓冲液A、醋酸盐或拥挤试剂中的至少一种；可选的，所述扩增缓冲液中包含dNTPs、NTPs、ATP、缓冲液A、磷酸肌酸、肌酸激酶、醋酸盐或拥挤试剂中的至少一种；可选的，所述缓冲液A包括Tris缓冲液、HEPES缓冲液或MOPS缓冲液；可选的，所述醋酸盐包括醋酸钾或醋酸钠；可选的，所述拥挤试剂包括聚乙二醇、聚乙烯醇、聚氧化乙烯、葡聚糖或聚蔗糖；可选的，所述拥挤试剂为平均分子量范围为8000
‑
35000的聚乙二醇；可选的，所述拥挤试剂为平均分子量为35000的聚乙二醇。6.根据权利要求5所述的等温核酸检测试剂盒，其特征在于，所述报告分子为单链RNA，所述单链RNA的一端修饰荧光基团，另一端修饰淬灭基团；可选的，所述单链RNA的5
’
端修饰荧光基团F，3
’
端修...

【专利技术属性】
技术研发人员：ꢀ七四专利代理机构，
申请(专利权)人：北京盛因生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：