鸡白痢沙门氏菌噬菌体Pu29及其在富集分离沙门氏菌中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种鸡白痢沙门氏菌噬菌体Pu29及其在富集分离沙门氏菌中的应用，其保藏编号为：CCTCC NO：M 2021169。所述偶联物PhagePu29

【技术实现步骤摘要】
鸡白痢沙门氏菌噬菌体Pu29及其在富集分离沙门氏菌中的应用


[0001]本专利技术涉及食品安全领域，具体涉及一种鸡白痢沙门氏菌噬菌体Pu29及其在富集分离沙门氏菌中的应用。

技术介绍

[0002]沙门氏菌(Salmonella spp.)作为重要的肠道致病菌之一，宿主广泛，能够引起各种动物的沙门氏菌病。鸡白痢沙门氏菌(Salmonella pullorum)是沙门氏菌属鸡血清型的一种生物型。该型菌株具有高度适应专一宿主的特点，禽类中鸡最易感，火鸡次之。不同品种的鸡，易感性不同；母鸡的患病率比公鸡高。不同日龄的鸡易感性也不同，其感染症状主要为白色下痢和呼吸困难，病死率高达90％～100％。成年鸡多为隐性感染并且终身带菌，带菌母鸡可垂直传播给雏鸡，雏鸡之间也可以水平传播，因而极易导致鸡白痢在鸡群中的大范围流行，造成极大的经济损失。世界动物卫生组织(OIE)将鸡白痢列为B类疫病，我国将其列为二类疫病。鸡白痢沙门氏菌为细胞内寄生菌，药物治疗只能缓解临床症状而不能根除，而且鸡肉制品中一旦存在药物残留则会对人的健康产生影响一。因此，鸡白痢沙门氏菌的检测在预防和控制方面尤为重要。为了实现对鸡白痢沙门氏菌的快速检测，针对预处理样品中的鸡白痢沙门氏菌进行快速准确的富集更是必不可少。
[0003]免疫磁珠分离技术(Immunomagnetic Separation，IMS)利用经过修饰的磁性微球作为载体进行目标物的捕获及富集，一般由载体微球和功能化配基结合而成。为了富集样品中的目的细菌，将特异性物质(如特异性抗体等)包被于纳米磁性微球表面，当在外加磁场的磁力作用下，磁珠复合物会被吸附到磁极的一端，实现特异性富集目标细菌的效果，以达到提高有害细菌检出率的目的且大大缩短了检测时间。此外，还可以弥补传统检测方法的不足，即能够富集VBNC(不能培养却存在，viable but non
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culture)性质的目标细菌。
[0004]目前为止，纳米磁珠技术在食品基质中已被广泛应用，例如肉制品、果汁、蔬菜及牛奶等样品的致病菌检测。食品中污染的致病菌数量通常较少，且基质复杂，常规分析方法难以实现对致病菌进行高灵敏和高特异性的检测。免疫磁分离技术通过免疫吸附和磁场作用可实现食品样品中少量致病菌的特异性分离富集，达到了后续分析检测的纯度和数量。
[0005]现在应用于病原微生物前富集分离的免疫磁珠分离技术中，纳米微球表面修饰的配基主要是特异性抗体，但特异性抗体一般价格昂贵且较难以获取，检测成本较高。寻找可与致病菌特异性结合的生物亲和分子并将其应用于致病菌的磁分离技术值得进一步探究。与抗体相比，噬菌体具有许多优势，即参与宿主识别的噬菌体蛋白极其稳定，噬菌体易于分离和繁殖，并且可以储存相当长的时间。这些特征使得噬菌体有望成为一种廉价且功能齐全的工具，在细菌的免疫检测过程中具有替代的抗体潜力。

技术实现思路

[0006]本专利技术第一目的是提供了一种鸡白痢沙门氏菌噬菌体Pu29。
[0007]为实现上述目的，本专利技术所设计一种鸡白痢沙门氏菌噬菌体(Salmonella pullorum bacteriophage)Pu29，其保藏编号为：CCTCC NO：M 2021169。
[0008]上述鸡白痢沙门氏菌噬菌体(Salmonella pullorum bacteriophage)Pu29，中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为：CCTCC M2021169，保藏日期为2021年1月29日，地址：中国武汉武汉大学。
[0009]上述鸡白痢沙门氏菌噬菌体(Salmonella pullorum bacteriophage)Pu29为实验室分离纯化得到，其特异性强，能够识别不同血清型的沙门氏菌，并且不能识别其他种属的细菌；其具有快速吸附沙门氏菌的特点(15min可达到最大吸附速率)；其具有高pH稳定性(3
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12)和热稳定性(30℃
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90℃)。
[0010]上述鸡白痢沙门氏菌噬菌体(Salmonella pullorum bacteriophage)Pu29通过第二代基因组测序法得到其基因组，采用生物信息学方法分析其基因组。随后结合其透射电镜结果，所述噬菌体Pu29属于长尾科(Siphoviridae family)噬菌体。
[0011]本专利技术第二目的是一种沙门氏菌噬菌体纳米磁珠偶联物PhagePu29
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MBs及其制备方法，所述偶联物PhagePu29
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MBs为权利要求1所述鸡白痢沙门氏菌噬菌体Pu29与羧基磁珠偶联得到的复合物。
[0012]进一步地，所述羧基磁珠的直径为200nm。
[0013]制备含有上述沙门氏菌噬菌体纳米磁珠偶联物PhagePu29
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MBs的PBS缓冲液的方法，包括以下步骤：
[0014]1)将噬菌体Pu29活化；
[0015]2)将羧基磁珠进行活化，得到活化羧基磁珠；
[0016]3)将噬菌体Pu29与活化的羧基磁珠进行偶联，得到含有沙门氏菌噬菌体纳米磁珠偶联物PhagePu29
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MBs的PBS缓冲液，且含有沙门氏菌噬菌体纳米磁珠偶联物PhagePu29
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MBs的PBS缓冲液中，PBS的摩尔浓度为0.05mol/L，牛血清白蛋白(BSA)的质量体积浓度为15g/L，
[0017]每毫升PBS缓冲液中，沙门氏菌噬菌体纳米磁珠偶联物PhagePu29
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MBs的含量为2mg。
[0018]进一步地，所述步骤1)中，噬菌体Pu29活化方法如下：
[0019]将噬菌体Pu29贮存液与对数期的鸡白痢沙门氏菌CVCC C519混合，液体培养，过滤，得到噬菌体Pu29液体，于4℃备用；且噬菌体Pu29液体使用滴度为：10
10
PFU/mL。
[0020]上述噬菌体液体的滴度的测定方法如下：
[0021]首先进行噬菌体液体10倍梯度稀释，按从稀释倍数高到低的方向倒入4mL含有200μL宿主菌的0.7％琼脂LB培养基，37℃培养6
‑
8h，观察噬菌斑和个数，即为噬菌体滴度。
[0022]上述羧基磁珠活化的制备方法如下：
[0023]1)将直径为200nm的羧酸修饰的磁珠经超声分散充分混匀后，得到分散磁珠，
[0024]2)取100μL分散磁珠到1.5mL离心管中，置于磁性分离架上，待固液分离后去除上清液，保留磁珠；加入200μL 2
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(N
‑
吗啉)乙磺酸(MES)溶液到上述离心管中，混匀置于磁性分离架上，待固液分离后去除上清液，重复该步骤1次，加入N
‑
羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS)(100μL，20mg/mL)和1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)(200μL，20mg/mL本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种鸡白痢沙门氏菌噬菌体(Salmonella pullorum bacteriophage)Pu29，其保藏编号为：CCTCC NO：M 2021169。2.一种沙门氏菌噬菌体纳米磁珠偶联物PhagePu29
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MBs，其特征在于：所述偶联物PhagePu29
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MBs为权利要求1所述鸡白痢沙门氏菌噬菌体Pu29与羧基磁珠偶联得到的复合物。3.根据权利要求2所述沙门氏菌噬菌体纳米磁珠偶联物PhagePu29
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MBs，其特征在于：所述羧基磁珠的直径为200nm。4.一种制备含有权利要求2所述沙门氏菌噬菌体纳米磁珠偶联物PhagePu29
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MBs的PBS缓冲液的方法，其特征在于：包括以下步骤：1)将噬菌体Pu29活化；2)将羧基磁珠进行活化，得到活化羧基磁珠；3)将噬菌体Pu29与活化的羧基磁珠进行偶联，得到含有沙门氏菌噬菌体纳米磁珠偶联物PhagePu29
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MBs的PBS缓冲液，且含有沙门氏菌噬菌体纳米磁珠偶联物PhagePu29
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MBs的PBS缓冲液中，PBS的摩尔浓度为0.05mol/L，牛血清白蛋白的质量体积浓度为15g/L，每毫升PBS缓冲液中，沙门氏菌噬菌体纳米磁珠偶联物PhagePu29
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MBs的含量为2mg。5.根据权利要求4所述沙门氏菌噬菌体纳米磁珠偶联物PhagePu29
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MBs的制备方法，其特征在于：所述步骤1)中，噬菌体Pu29活化方法如下：将噬菌体Pu29贮存液与对数期的鸡白痢沙门氏菌CVCC...

【专利技术属性】
技术研发人员：王小红，丁一峰，王佳，邵彦春，黄晨曦，张宇，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：