【技术实现步骤摘要】
一种在生物反应器中连续培养I群禽腺病毒的方法
[0001]本专利技术属于兽用生物制品
，具体涉及一种在生物反应器中连续培养I群禽腺病毒的方法。
技术介绍
[0002]I群禽腺病毒可引起鸡心包积液综合征及包涵体肝炎疾病的流行和扩散，能给禽类养殖业造成重大损失。I群禽腺病毒可被制备成灭活疫苗来实现上述禽类疾病的有效防控，目前，I群禽腺病毒的培养大多依靠来自发病鸡肝脏制备的组织，也有使用鸡胚通过卵黄囊接种、鸡胚原代肝细胞以及LMH细胞进行禽腺病毒培养的案例，但这些禽腺病毒培养工序繁琐、成本较高、原料来源受限，不能满足疫苗规模化生产需要，而且存在外源病毒污染的风险。大规模生物反应器细胞悬浮与病毒增殖技术是当代最先进的疫苗抗原生产工艺技术，其可利用LMH全悬浮细胞在生物反应器中增殖病毒，但是，生物反应器及其配套的生物反应器袋子均为一次性物品，袋子费用较高，目前只能一次性收毒，无法多次收毒。如果多次收毒，易出现污染等问题，且反应器运行参数要求严格控制，导致利用生物反应器繁毒成本较高，从而难以满足疫苗规模化生产需要。
专利技...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种在生物反应器中连续培养I群禽腺病毒的方法，其特征在于，步骤如下：(1)第一次收毒将全悬浮LMH细胞接种于生物反应器中培养，当LMH细胞数量达到4.0～6.0
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106个/mL时，按MOI值0.01～0.04接入种毒，静置吸附1h，按LMH细胞培养液体积比加入细胞维持液，继续培养，当细胞活率下降到85～90％时，按LMH细胞培养液体积比补加细胞悬液至生物反应器袋中继续培养，继续培养至细胞密度为1.5～2.0
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106个/mL、细胞活率为40～60％时收获病毒液；(2)第二次收毒在完成第一次收毒后，向生物反应器袋中加入细胞悬液，按MOI值0.005～0.02补加种毒，静置吸附1h，按LMH细胞培养液体积比加入细胞维持液，继续培养至细胞密度为1.5～2.0
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106个/mL、细胞活率为40～60％时收获病毒液；(3)第三次收毒在完成第二次收毒后，向生物反应器袋中加入细胞悬液，按MOI值0.005～0.02补加种毒，静置吸附1h，按LMH细胞培养液体积比加入细胞维持液，继续培养至细胞密度为1.5～2.0
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106个/mL、细胞活率为40～60％时收获病毒液；在本次病毒液收获后，终止病毒培养。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，全悬浮LMH细胞由如下方法制备而成：将LMH贴壁细胞复苏，选择汇合度大于80％的贴壁细胞消化分散，并进行有限稀释法克隆LMH细胞；将消化细胞使用含10％胎牛血清的DME/F12(1:1)培养基稀释至5～10个/mL，并加到96孔细胞培养板中，每孔加0.1mL(即0.5～1个细胞/孔)，放置37℃，5％CO2培养箱培养7d后，取出观察，选择单克隆生长孔，将生长良好的细胞转移到24孔板再做克隆，培养至密度为2～3
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107个/mL，进行消化分散；将消化细胞接种至JSBio TM LMH SFM无血清培养基上，每24h取样计数，直至培养72h；待细胞活率低于85％、细胞倍增时间大于48h时，800rpm/min离心5min，弃掉上清液，使用无血清培养基调整细胞密度至1.5～2.0
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106个/mL后继续培养至72h；重复这一培养过程，直至每72h正常稀释传代，连续10代保持48h时活细胞密度倍增且72h时细胞密度为起始密度的4.5～6.5倍，细胞活率高于95％，得到LMH全悬浮细胞；对驯化好的LMH全悬浮细胞进行液氮冻存保存。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，全悬浮LMH细胞在生物反应器中的培养条件为：温度为30～37℃，pH为6.9～7.5，Do控制在70～100％，转速40rpm/min。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，细胞维持液选自细胞培养液JSBio TM CD EB66 488。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，生物反应器中LMH细胞培养液与所加入的细胞维持液的体积比选自1:1～1:3；生物反应器中LMH...
【专利技术属性】
技术研发人员：卢金凤，李志英，葛栋，唐率钧，冯晶晶，齐昊南，王平，李乃鹏，
申请(专利权)人：青岛中仁澳兰生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：
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