一种鸡传染性法氏囊病毒悬浮种毒的培养方法技术

本发明专利技术涉及兽用生物制品技术领域，且公开了一种鸡传染性法氏囊病毒悬浮种毒的培养方法，包括如下步骤：S1：从液氮中迅速取出LMH全悬浮细胞，在35℃

【技术实现步骤摘要】
一种鸡传染性法氏囊病毒悬浮种毒的培养方法


[0001]本专利技术涉及兽用生物制品
，具体为一种鸡传染性法氏囊病毒悬浮种毒的培养方法。

技术介绍

[0002]鸡传染性法氏囊病(IBD)是由鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)引起3～6周龄雏鸡的急性、接触性传染病，不仅能使雏鸡发病死亡，而更重要的是IBDV破坏雏鸡免疫中枢器官——法氏囊，导致不同程度、甚至长期的免疫抑制。
[0003]目前，仍然是中国养殖场主要预防的传染性疾病。疫苗接种是预防和控制IBD的主要方法，活疫苗毒力弱的免疫效果差，毒力较强的对法氏囊有伤害且影响免疫效果；灭活疫苗保留了完整的病毒结构在不影响免疫效果的同时大大提高了安全性能。在IBDV灭活疫苗生产中，以往均采用鸡胚或者鸡胚成纤维细胞制备IBDV抗原，需要消耗大量SPF鸡胚，生产周期长，易污染，生产效率很低，而且病毒含量较低、稳定性差，从而导致疫苗生产成本高及效力不稳定等问题。目前也有DF
‑
1、MDCK、Vero等细胞可以用于IBDV的培养，收获病毒液，灭活后制备成成品疫苗，但该工艺采用转瓶或者细胞工厂等传统的贴壁生产方式生产，存在工艺繁琐，效价不理想，依赖血清，劳动强度大，受到培养空间的限制而不能大规模放大；而且由于动物保护导致血清这块资源也会受到一定的影响。传统的疫苗生产方法受很多因素的限制，为了适应扩大化工业生产的需要，疫苗工作者迫切需要研究一种安全、高效的新型工艺，以替代现行的生产工艺。基于此，有疫苗工作者采用球载体搅拌式生物反应器实现了DF
‑
>1细胞微载体悬浮培养技术培养IBDV抗原，与转瓶培养相比有很大优势，能提高生产规模、产品质量和劳动效率；但是该培养需要借助微载体，细胞和球体接触部位营养环境较差，培养、取样观察及放大工艺复杂，成本高。随着细胞悬浮培养技术在工业生产上日益成熟，相较于微载体悬浮培养模式全悬浮细胞培养技术更易于放大，工艺简单快捷，大大降低成本，另外全悬浮培养可作到无血清培养，动物成分大大降低，获得抗原效价高，不良反应小，可大大提高劳动生产效率，减少劳动强度等优势而备受青睐。

技术实现思路

[0004](一)解决的技术问题
[0005]本专利技术的目的在于提供一种鸡传染性法氏囊病毒悬浮种毒的培养方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。
[0006](二)技术方案
[0007]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种鸡传染性法氏囊病毒悬浮种毒的培养方法，包括如下步骤：
[0008]S1：从液氮中迅速取出LMH全悬浮细胞，在35℃
‑
38℃水浴锅中迅速融化；
[0009]S2：待LMH全悬浮细胞完全融化后，在复苏细胞中加入约15
‑
20倍体积的JSBio TM LMH SFM无血清培养基，轻轻吹散后进行离心处理，倒掉上清液，加入JSBioTM LMH SFM无血
清培养基将细胞吹打重悬均匀；
[0010]S3：接种至125mL摇瓶中，并放置于二氧化碳摇床的5％CO2、37℃培养箱上进行悬浮培养；
[0011]S4：培养后，按照一定比例进行稀释传代，传至第3代细胞状态稳定后，方可用接毒培养；
[0012]S5：待细胞传至第四代时，培养48
‑
60H后，按照MOI＝0.1
‑
1.0接入无血清悬浮培养IBDV BJQ902株F1种毒，30
‑
37℃二氧化碳培养箱(5％CO2)中静置吸附0.5
‑
1.5H，按照LMH细胞培养液体积比加入细胞维持液，调整细胞密度为2.0～3.0
×
106个/ML，并调节二氧化碳培养箱的转速为60～110rpm/min继续培养，培养至细胞密度为1.0～1.5
×
106个/ML、细胞活率为40～60％时收获病毒液，此时接毒后的培养时间大概为48
‑
72H，经病毒含量TCID
50
检测可达10
8.75～9.25
/0.1ML。
[0013]优选的，所述S2中吹散后离心的速度为经600
‑
800rpm/min，离心时间为3
‑
5min。
[0014]优选的，所述S3中摇床速度为110～150rpm/min。
[0015]优选的，所述S3悬浮培养时间为72小时。
[0016]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
[0017]该鸡传染性法氏囊病毒悬浮种毒的培养方法；
[0018]1、LMH贴壁细胞可以培养鸡传染性法氏囊病毒，并且经过驯化后鸡传染性法氏囊病毒对LMH全悬浮细胞有更明显的敏感性，获得比LMH贴壁细胞培养抗原更高的病毒含量的悬浮抗原；LMH全悬浮接毒IBDV后培养病毒的最佳条件：MOI：0.5，接毒后吸附0.5H，接毒后细胞培养温度是32℃，接毒后转速是70rpm，且相同病毒含量的悬浮抗原的免疫原性与传统方式用鸡胚成纤维细胞制备的抗原的免疫原性相同甚至更优；
[0019]2、制备的鸡传染性法氏囊病毒悬浮种毒病毒含量高，TCID
50
可达10
9.5
/0.1ML；
[0020]3、悬浮培养整个过程都是无血清培养，摆脱了血清依赖，这样可以避免由于血清而引起的外源病毒影响，并降低由于血清引起的副反应，可大大提高产品品质；
[0021]4、培养周期短，将全悬浮LMH细胞接种于摇瓶中培养，当LMH细胞数量达到4.0～9.0
×
106个/ML时，按照MOI＝0.1
‑
1.0接入种毒，30
‑
37℃二氧化碳培养箱(5％CO2)中静置吸附0.5
‑
1.5H，按照LMH细胞培养液体积比加入细胞维持液，调整细胞密度为2.0～3.0
×
106个/ML，并调节二氧化碳培养箱的转速为110rpm/min～150rpm/min继续培养，培养至细胞密度为1.0～1.5
×
106个/ML、细胞活率为40～60％时收获病毒液，此时接毒后的培养时间大概为48
‑
72H，经病毒含量TCID
50
检测可达10
8.75～9.5
/0.1ML，该培养方式周期短而且收获的病毒含量较高，可以用于大规模生产。
具体实施方式
[0022]下面将结合本专利技术实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0023]本专利技术提供一种技术方案：一种鸡传染性法氏囊病毒悬浮种毒的培养方法，包括如下步骤：
[0024]S1：从液氮中迅速取出LMH全悬浮细胞，在35℃
‑
38℃水浴锅中迅速融化；<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种鸡传染性法氏囊病毒悬浮种毒的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：S1：从液氮中迅速取出LMH全悬浮细胞，在35℃
‑
38℃水浴锅中迅速融化；S2：待LMH全悬浮细胞完全融化后，在复苏细胞中加入约15
‑
20倍体积的JSBio TM LMH SFM无血清培养基，轻轻吹散后进行离心处理，倒掉上清液，加入JSBioTM LMH SFM无血清培养基将细胞吹打重悬均匀；S3：接种至125mL摇瓶中，并放置于二氧化碳摇床的5％CO2、37℃培养箱上进行悬浮培养；S4：培养后，按照一定比例进行稀释传代，传至第3代细胞状态稳定后，方可用接毒培养；S5：待细胞传至第四代时，培养48
‑
60H后，按照MOI＝0.1
‑
1.0接入无血清悬浮培养IBDV BJQ902株F1种毒，30
‑
37℃二氧化碳培养箱(5％CO2)中静置吸附0.5
‑
1.5H，按照LMH细胞培养液体积比加入细胞维持液，...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢金凤，刘拂晓，李志英，葛栋，苏睿聪，孙晓荣，姜雨佳，马铭晨，冯晶晶，王平，吴延功，
申请(专利权)人：青岛中仁澳兰生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：