高效扩增人流感病毒的方法和试剂技术

本发明专利技术提供了一种高效扩增人流感病毒的的方法和试剂。针对流感病毒复制的特性，本发明专利技术人经由广泛的筛选工作，提出了可应用于更高效率地扩增流感病毒的改良型维持培养液以及培养方法。所述维持培养液以及培养短期内可获得高滴度的病毒，成本低廉且安全稳定。成本低廉且安全稳定。

【技术实现步骤摘要】
高效扩增人流感病毒的方法和试剂


[0001]本专利技术属于病毒学领域，更具体地，本专利技术涉及高效扩增人流感病毒的的方法和试剂。

技术介绍

[0002]流感病毒属正粘液病毒科，流感病毒属包括甲、乙、丙三型，甲型抗原变异性最强，感染人类和其他动物，引起中、重度疾病，侵袭所有年龄组人群，常引起世界性大流行。乙型变异性较弱，仅感染人类，一般引起轻微的疾病，主要侵袭儿童，可引起局部爆发。丙型抗原性比较稳定，仅引起婴幼儿感染和成人散发病例。甲型流感病毒根据H和N抗原不同，又分为许多亚型，H可分为15个亚型(H1～H15)，N有9个亚型(N1～N9)。其中仅H1N1、H2N2、H3N2主要感染人类，其它许多亚型的自然宿主是多种禽类和动物。其中对禽类危害最大的为H5、H7和H9亚型毒株。一般情况下，禽流感病毒不会感染鸟类和猪以外的动物。具有高致病性的H5N1、H7N7、H9N2等禽流感病毒，一旦发生变异而具有人与人的传播能力，会导致人间禽流感流行，预示着禽流感病毒对人类已具有很大的潜在威胁。与以前面发现的毒株相比，如果在血凝素分子特异性抗原决定簇(抗原表位)上发生了突变，新的毒株被认为是先前毒株的异种变异类型，具有流行病学意义，可以造成流感的流行。流感的传播途径以空气飞沫传播为主，其次是通过病毒污染的茶具、食具、毛巾等间接传播，密切接触也是传播流感的途径之一。
[0003]流感病毒给人类造成的损失不仅仅是超额的死亡率，更涉及到各种形式的直接或间接的经济损失。目前公认的预防流感的最佳方法是接种流感疫苗。对大多数国家和地区而言，安全有效的灭活疫苗一直是预防流感的基础。流感疫苗已成为当今受人重视的、销售额最大的疫苗品种之一。这就需要大量地、高效地培养流感病毒，以备于疫苗的制备。
[0004]与传统的鸡胚生产工艺相比，基于细胞培养技术的生产工艺在流感大流行时可实现快速大规模培养，以应对鸡胚供应不足的问题，因此逐渐成为主流生产方式。近年来，随着各类流行传染病的爆发，流感疫苗的需求也日益增加。
[0005]但是，本领域现有细胞培养生产工艺产能仍相对低下，提高流感病毒在细胞中的扩增效率迫在眉睫。相对于鸡胚法和其它细胞基质来生产流感病毒，MDCK细胞悬浮培养技术应运而生，这一技术中培养液的运用是保证细胞生长和病毒复制的核心之一。然而，目前在流感病毒生产阶段，使用的病毒维持培养液大多和细胞生长阶段所用的细胞生长培养液是同一款，引起病毒复制所需营养物质需求的不足，最终影响病毒在细胞内的扩增效率，导致病毒产量低下。因此有必要针对流感病毒复制的特性，来设计更高效率地扩增流感病毒的维持培养液。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种高效扩增人流感病毒的的方法和试剂。
[0007]在本专利技术的第一方面，提供一种用于扩增流感病毒的方法，所述方法包括：(1)提
供流感病毒生产细胞，其培养于基本培养液中；(2)提供含有添加物的无血清维持培养液，所述添加物选自：(a)丁酸钠和半乳糖，或(b)丁酸钠；(3)将(2)的培养液加入(1)的病毒生产细胞的基本培养液中；以流感病毒感染所述病毒生产细胞，培养细胞，生产流感病毒。
[0008]在一种或多种实施方式中，(a)中，所述丁酸钠在所述无血清维持培养液中的含量为：20～200mg/L，且所述半乳糖在所述无血清维持培养液中的含量为：5～80mg/L。
[0009]在一种或多种实施方式中，(b)中，所述丁酸钠在所述无血清维持培养液中的含量为：20～200mg/L。
[0010]在一种或多种实施方式中，(a)中，所述丁酸钠在所述无血清维持培养液中的含量为：25～150mg/L，较佳地为30～120mg/L，更佳地为40～100mg/L；且，所述半乳糖在所述无血清维持培养液中的含量为：10～60mg/L，较佳地为20～50mg/L。
[0011]在一种或多种实施方式中，(b)中，所述丁酸钠在所述无血清维持培养液中的含量为：25～150mg/L，较佳地为30～120mg/L，更佳地为40～100mg/L。
[0012]在一种或多种实施方式中，(a)或(b)中，所述丁酸钠在所述无血清维持培养液中的含量例如为：28mg/L、48mg/L、58mg/L、68mg/L、78mg/L、88mg/L、100mg/L、150mg/L等。
[0013]在一种或多种实施方式中，(a)中，所述半乳糖在所述无血清维持培养液中的含量例如为：8、18、28、38、48、58、68mg/L等。
[0014]在一种或多种实施方式中，所述的无血清维持培养液包括选自：Xeno
‑
SFM维持培养液，Xeno
‑
CDM维持培养液，Ex
‑
Cell培养液。
[0015]在一种或多种实施方式中，所述的流感病毒生产细胞为非人哺乳动物细胞；较佳地为MDCK细胞；较佳地，(1)中所述的细胞培养液为MDCK细胞培养液。
[0016]在一种或多种实施方式中，所述的流感病毒为人流感病毒；较佳地，所述的流感病毒为甲型流感病毒；较佳地，所述甲型流感病毒根据H抗原和N抗原的不同，H选自H1～H15，N选自N1～N9；更佳地，所述甲型流感病毒包括选自：H1N1病毒、H9N2病毒、H5N1病毒、H7N9病毒。
[0017]在一种或多种实施方式中，(3)中，将(2)的培养液加入(1)的流感病毒生产细胞的培养液中时，所述(2)的培养液与所述(1)的流感病毒生产细胞的细胞培养液的比例为1:0.5～1:2.5，较佳地为1:0.9～1:2.2，更佳地为1:0.9～1:1.5。
[0018]在一种或多种实施方式中，(3)中，以流感病毒感染所述病毒生产细胞时，MOI＝0.001～0.1，更佳地MOI＝0.005～0.05(进一步优选约0.01)。
[0019]在一种或多种实施方式中，(3)中，所述的培养为悬浮培养。
[0020]在一种或多种实施方式中，所述(2)的培养液与所述(1)的病毒生产细胞的培养液的比例例如为：1:0.95，1:1，1:1.2，1:1.3等。
[0021]在一种或多种实施方式中，以流感病毒感染所述病毒生产细胞后，添加TPCK
‑
胰酶；较佳地，所述TPCK
‑
胰酶为终浓度为5
±
3μg/mL，较佳地5
±
2μg/mL，更佳地5
±
1μg/mL的TPCK
‑
胰酶。
[0022]在本专利技术的另一方面，提供一种生产流感病毒疫苗的方法，所述方法包括：以前面任一所述的方法扩增流感病毒；将获得的流感病毒进行灭活、减毒或从所获得的流感病毒中分离抗原，加工获得具有免疫原性的流感病毒疫苗。
[0023]在一种或多种实施方式中，步骤(3)后获得的病毒，还可进行病毒的传代，也即可
进行新一轮的细胞感染和扩增。
[0024]在本专利技术的另一方面，提供一种制备用于扩增流感病毒的无血清维持培养液的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于扩增流感病毒的方法，其特征在于，所述方法包括：(1)提供流感病毒生产细胞，其培养于基本培养液中；(2)提供含有添加物的无血清维持培养液，所述添加物选自：(a)丁酸钠和半乳糖，或(b)丁酸钠；(3)将(2)的培养液加入(1)的病毒生产细胞的基本培养液中；以流感病毒感染所述病毒生产细胞，培养细胞，生产流感病毒。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，(a)中，所述丁酸钠在所述无血清维持培养液中的含量为：20～200mg/L，且所述半乳糖在所述无血清维持培养液中的含量为：5～80mg/L；和/或(b)中，所述丁酸钠在所述无血清维持培养液中的含量为：20～200mg/L。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，(a)中，所述丁酸钠在所述无血清维持培养液中的含量为：25～150mg/L，较佳地为30～120mg/L，更佳地为40～100mg/L；且，所述半乳糖在所述无血清维持培养液中的含量为：10～60mg/L，较佳地为20～50mg/L；和/或(b)中，所述丁酸钠在所述无血清维持培养液中的含量为：25～150mg/L，较佳地为30～120mg/L，更佳地为40～100mg/L。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的无血清维持培养液包括选自：Xeno
‑
SFM维持培养液，Xeno
‑
CDM维持培养液，Ex
‑
Cell培养液；或所述的流感病毒生产细胞为非人哺乳动物细胞；较佳地为MDCK细胞；较佳地，(1)中所述的细胞培养液为MDCK细胞培养液；或所述的流感病毒为人流感病毒；较佳地，所述的流感病毒为甲型流感病毒；较佳地，所述甲型流感病毒根据H抗原和N抗原的不同，H选自H1～H15，N选自N1～N9；更佳地，所述甲型流感病毒包括选自：H1N1病毒、H9N2病毒、H5N1病毒、H7N9病毒。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，(3)中，将(2)的培养液加入(1)的流感病毒生产细胞的培养液中时，所述(2)的培养液与所述(1)的流感病毒生产细胞的细胞培养液的比例为1:0.5～1:2.5，较佳地为1:0.9～1:2.2，更佳地为1:0.9～1:...

【专利技术属性】
技术研发人员：权利要求书二页说明书一一页附图三页，
申请(专利权)人：上海荣盛生物药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：