一种水痘-带状疱疹病毒活疫苗原液的制备方法技术

本发明专利技术提供了一种水痘

【技术实现步骤摘要】
一种水痘
‑
带状疱疹病毒活疫苗原液的制备方法


[0001]本专利技术属于基因工程药物和疫苗制造领域，更具体地，本专利技术涉及一种新型的水痘
‑
带状疱疹病毒活疫苗原液的制备方法。

技术介绍

[0002]水痘
‑
带状疱疹病毒是一种具有高度传染性的疱疹病毒，既可引发水痘，也可引发带状疱疹(HZ)；前者通常见于儿童期和年轻成年人，后者则是潜伏病毒再活化和复制导致。水痘是一种常见、多发、有高度接触传播性的儿童急性传染病，发热的同时伴全身水疱性发疹。带状疱疹(HZ)是由潜伏在感觉神经节的水痘
‑
带状疱疹病毒复发感染导致的一种急性感染性皮肤疾病。当抵抗力低下或劳累、感染、感冒时，病毒可再次生长繁殖，并沿神经纤维移至皮肤，使受侵犯的神经和皮肤产生强烈的炎症。常见的严重并发症有疱疹感染后神经痛(PHN)和眼病带状疱疹。
[0003]现有的水痘
‑
带状疱疹病毒疫苗类型较少，在韩国获得许可的疫苗是从一种来自当地的特定分离株开发而来；除此之外，所有的配方都基于日本Takahash分离的VZV
‑
Oka株。鉴于此类病毒疫苗制备工艺难度高，全球仅有2种批准上市的带状疱疹疫苗，其一为默克公司的Zostavax疫苗，于2006年获得上市许可，实质为高剂量VZV
‑
Oka株减毒活疫苗。另一为葛兰素史克(GSK)公司的亚单位佐剂疫苗(HZ/SU)，结合了VZV糖蛋白gE和含有刺激先天性免疫反应激活的AS01B佐剂以增强特异性抗体和细胞介导的反应，以期诱导更强烈和更持久的免疫反应；但是，该亚单位疫苗的副反应比较强。
[0004]因重组亚单位疫苗的副反应较强，减毒活疫苗的规模化生产、工艺优化显得更为迫切。
[0005]目前，病毒减毒活疫苗生产原液的纯化工艺中，主要采用超声破碎、离心、过滤制备减毒活疫苗原液，在减毒活疫苗原液及成品溶液的过滤处理中，主要采用滤柱过滤和布式滤囊过滤两种方法。尽管这两种方法在实际生产中的应用已较成熟和稳定，但所获得的病毒减毒活疫苗原液还存在一些亟待改善的方面，主要是细胞/病毒培养过程中的杂质依然不能有效去除。尽管可采用MRC
‑
5细来生产病毒，该细胞为人源细胞，但对人体来说，依然是外源性物质，产生较多副反应。目前，包括默克在内的已上市疫苗，只是采用离心或过滤的方式去除较大的细胞碎片，均存在该潜在的安全性问题。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种新型的水痘
‑
带状疱疹病毒活疫苗原液的制备方法。
[0007]在本专利技术的第一方面，提供一种水痘
‑
带状疱疹病毒疫苗原液的制备方法，所述水痘
‑
带状疱疹病毒疫苗为活疫苗，所述方法包括：
[0008](1)以水痘
‑
带状疱疹病毒感染病毒生产细胞以生产病毒，收获包含病毒感染细胞的细胞液；在细胞液中添加组合试剂1；所述组合试剂1包括：人血白蛋白、谷氨酸钠和蔗糖；
[0009](2)对(1)中细胞液进行超声破碎，获取上清液；进行超滤浓缩，获得浓缩液；
0.001～0.01接种病毒。
[0030]在一种或多种实施方式中，MRC
‑
5细胞在感染病毒后，利用细胞维持液进行继续培养，维持液为含2～5％血清的HDC培养液。
[0031]在一种或多种实施方式中，待病毒接种后，细胞的CPE达到70
±
5％时收获细胞，洗涤细胞，消化。
[0032]在一种或多种实施方式中，将含有病毒的上清液采用100KD中空纤维膜进行超滤浓缩，浓缩倍数10
‑
20倍，即为病毒浓缩液。
[0033]在一种或多种实施方式中，所述水痘
‑
带状疱疹病毒疫苗原液包括成品或半成品。
[0034]本专利技术的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
具体实施方式
[0035]本专利技术人致力于优化水痘
‑
带状疱疹病毒活疫苗的纯化工艺。不同于其它类型的疫苗(例如灭活疫苗，蛋白疫苗等)，本专利技术所需制备的疫苗为病毒活疫苗。尽管在其它类型的病毒疫苗制备中可能无需考虑，但对于病毒活疫苗而言，如何保持病毒的高活性是至关重要的。在病毒活疫苗的整个制备和纯化工艺中，一方面需要尽可能地避免或减少病毒失活；另一方面则是尽可能地达到高的蛋白去除率。
[0036]为此，本专利技术人进行了深入的过程研究和实验分析，包括工艺流程、过程处理、添加物及添加时机的选择、温度条件的选择等，提供了一种新型水痘和带状疱疹疫苗原液的纯化方法，包括病毒生产、细胞破碎、超滤膜浓缩以及分子筛层析的步骤，期间进行适时的病毒保护以及温度调节。
[0037]如本文所用，除非另外说明，所述的“细胞”或“病毒生产细胞”是指适用于进行水痘
‑
带状疱疹病毒扩增/繁殖的细胞，其被在适当的培养基中培养，感染水痘
‑
带状疱疹病毒后，可为水痘
‑
带状疱疹病毒提供适当的组装环境。所述的细胞较佳地为MRC
‑
5细胞。
[0038]如本文所用，除非另外说明，“细胞生长液”为使得MRC
‑
5细胞(感染前)生长、传代的培养液，较佳地为含5～10％血清的HDC培养液。
[0039]如本文所用，除非另外说明，“细胞维持液”为用于培养感染病毒后的MRC
‑
5细胞，使得病毒能够在细胞内被扩繁的培养液，较佳地为含2～5％血清的HDC培养液。
[0040]如本文所用，“传代”通常包括：使水痘
‑
带状疱疹病毒在细胞培养物中复制；例如从培养物上清液收集复制的病毒；和将收集的复制病毒转移到未感染的细胞培养物中。可重复该过程。
[0041]根据本领域一般的考虑，由于所需制备及纯化的为病毒活疫苗，会在获得病毒收集液后进行浓缩、直接备于后续应用。然而，本专利技术人观测到，超滤浓缩工艺后虽然可以显著地降低病毒液体积且保留或一定程度提高病毒滴度、病毒回收率较高，病毒浓缩液中仍然有较多的杂蛋白，蛋白去除率难以满足要求。
[0042]为了解决蛋白去除率低的问题，本专利技术人进行了深入研究分析，确定通过在过程中适时利用添加剂进行活性保护并引入层析工艺的方案。常规实践中一般认为层析工艺会导致活病毒的活性丧失，故本领域中未见有在病毒活疫苗制备工艺的下游纯化中应用层析技术的。为了解决活病毒的活性丧失的问题，本专利技术人进行了上游工艺的优化，应用有效的
添加成分(如含或不含人血白蛋白的组合试剂)，适时加入后，可较为有效地获得改进的效果。
[0043]本专利技术人找到了配合上述纯化过程的辅助保护试剂，在经水痘
‑
带状疱疹病毒感染、收集细胞液的阶段(细胞破碎前)，在病毒收集液中添加如表3中的含有人血白蛋白的添加成分；进而再进行细胞超声破碎、离心去除杂质(超滤前)本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种水痘
‑
带状疱疹病毒疫苗原液的制备方法，其特征在于，所述水痘
‑
带状疱疹病毒疫苗为活疫苗，所述方法包括：(1)以水痘
‑
带状疱疹病毒感染病毒生产细胞以生产病毒，收获包含病毒感染细胞的细胞液；在细胞液中添加组合试剂1；所述组合试剂1包括：人血白蛋白、谷氨酸钠和蔗糖；(2)对(1)中细胞液进行超声破碎，获取上清液；进行超滤浓缩，获得浓缩液；(3)在(2)的浓缩液中加入组合试剂2；所述组合试剂2包括：谷氨酸钠和蔗糖，进行分子筛层析，获得水痘
‑
带状疱疹病毒疫苗原液。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，(1)中，所述病毒生产细胞为MRC
‑
5细胞。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，(1)中，所述组合试剂1中，所述人血白蛋白在细胞液中的终浓度为1.5～10
‰
；较佳地2～6
‰
；更佳地2.5～5
‰
；或所述谷氨酸钠在细胞液中的终浓度为0.1～1
‰
；较佳地0.2
‑
0.6
‰
；或所述蔗糖在细胞液中的终浓度为10～100
‰
；较佳地30
‑
70
‰
。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，(2)中，...

【专利技术属性】
技术研发人员：喻志远，朱绍荣，宋丹，
申请(专利权)人：上海荣盛生物药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：