一种指示pH值的荧光探针及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种可通过颜色指示pH值的荧光探针及其制备方法和应用。该荧光探针的化学结构式为：可通过2

【技术实现步骤摘要】
一种指示pH值的荧光探针及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于分析化学
，涉及一种指示pH值的荧光探针及其制备方法与应用。

技术介绍

[0002]pH值的变化与许多生物反应的进行息息相关，而核酸检测技术作为分子生物学中的一项重要技术也与pH值的变化密切相关，其中环介导等温扩增技术（loop
‑
mediatedisothermal amplification，LAMP）因具有较高的灵敏度和较快的反应速率，备受研究者的青睐。环介导等温扩增在反应过程中进行大量的DNA复制，消耗大量的脱氧核糖核苷酸三磷酸（dNTPs），当dNTPs被消耗后会产生大量的焦磷酸根离子，这些焦磷酸根离子会导致整个反应体系中的pH值降低。因此，可以通过观察pH值的变化来判断是否含有目标核酸进行扩增反应。
[0003]常见的pH值检测方法有玻璃电极法，但其存在电化学干扰、尺寸大等缺陷，pH试纸检测方法只适用于粗略测量，均不适合用于微量检测，更不能达到核酸检测的目的；可用于检测细胞内而pH值的方法包括
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P核磁共振法，吸收光谱法等，但这些方法存在机械损伤，价格昂贵等缺点。虽然以上传统的方法可用于pH值的检测，但这些方法通常需要样品预处理和破坏细胞，操作复杂，在生物学研究中受到限制。基于荧光的pH检测方法响应快，在pH值由4变为9的过程中可实现由红光变黄绿光的变化，从而实现pH值的检测。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种检测pH的荧光探针，可通过荧光的变化实现对pH值4—9范围内的检测。
[0005]为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案。
[0006]一种指示pH值的荧光探针，该荧光探针的化学结构式1所示：式 1 化学结构式上述指示pH值的荧光探针的制备方法，通过以下步骤：
（1）将2
‑
（N
‑
吗啉代）乙烷磺酸（化合物1）加入至无水二氯甲烷溶液/三氯甲烷/氯仿/二氯乙烷中、再滴加草酰氯和二甲基甲酰胺，在氮气保护下，放入冰水浴中充分搅拌，反应完全后，过滤除去滤渣并浓缩滤液，可得化合物2。
[0007]（2）取靛红酸酐、冰醋酸和2
‑
氨基苯硫酚在45 ℃水浴环境下反应。待反应结束后，冷却至室温，倒入纯水中，析出黄褐色沉淀，使用氢氧化钠溶液调节体系的pH值近中性后，有大量黄褐色沉淀析出。减压过滤得到固体沉淀，并用饱和氯化钠溶液洗涤3次。将收集到的滤饼置于50 ℃烘箱中干燥。然后柱层析分离纯化得到黄褐色产物，即化合物3。 （3）取化合物3溶解在无水二氯甲烷/三氯甲烷/氯仿/二氯乙烷中，加入一定量三乙胺溶液。将混合物冷却至0 ℃，逐滴添加化合物2在无水二氯甲烷中，室温下搅拌反应至完全。纯水淬灭反应、收集有机层、干燥后减压旋蒸除去溶剂，柱层析纯化后可得化合物4。
[0008]（4）取化合物4溶于乙酸酐中，50 ℃下缓慢滴加硝酸和冰醋酸并搅拌反应。反应完成后，使用NaOH溶液中和过量的酸。采用二氯甲烷萃取所得混合物，有机层采用无水硫酸镁干燥，减压除去残留的溶剂，得到浅黄色固体状的粗硝基化合物。最后将粗产物溶解在四氢呋喃中，并加入10 ％Pd/C粉末，在室温下搅拌一段时间。过滤后，减压除去溶剂得到最终产物ABT
‑
Lys。
[0009]本专利技术的另一目的是提供一种上述指示pH值的荧光探针在核酸检测中的应用。
[0010]本专利技术的机理如下：本专利技术所述的探针具有2
‑
（2
’‑
氨基苯基）苯并噻唑基团，当pH值逐渐向酸性条件变化时，探针上氨基氢与苯并噻唑的氮原子形成分子内氢键形成ESIPT过程，此时红色荧光发生增强；而在碱性环境下，ESIPT过程阻断从而发出黄绿光；可采用荧光检测器通过检测一定波长下的颜色变化，实现pH值的检测。
[0011]本专利技术具有以下有益效果：本专利技术与常规微量pH值检测方法相比，可通过肉眼辨别颜色不同，实现pH值的检测；合成方法简单，步骤简洁，操作简便；具有广阔的应用前景。
附图说明
[0012]图1：实施例1中化合物4的1H NMR图谱；图2：实施例1中化合物4的
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C NMR图谱；图3：实施例1中化合物4的HR
‑
MS图谱；图4：实施例1中ABT
‑
Lys荧光探针的1H NMR图谱；图5：实施例1中ABT
‑
Lys荧光探针的
13
C NMR图谱；图6：实施例1中ABT
‑
Lys荧光探针的HR
‑
MS图谱；图7：实施例2中指示pH值的荧光探针分别在pH值4—9时的荧光发射光谱图；图8：实施例2中指示pH值的荧光探针分别在pH值4—9时呈现的不同颜色；图9：实施例3中荧光探针在2019
‑
nCoV可视化快速检测试剂盒中的应用图。
具体实施方式
[0013]实施例1 指示pH值的荧光探针的合成
1H), 8.04 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 7.59
ꢀ–ꢀ
7.55 (t, J = 7.2 Hz, 1H), 7.52
ꢀ–ꢀ
7.48 (t, J = 7.2, 1H), 7.35 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.31 (d, J = 2.6 Hz, 1H), 6.79 (dd, J = 8.7, 2.6 Hz, 1H), 5.49 (s, 2H), 3.35
ꢀ–ꢀ
3.30 (m, 4H), 3.27
ꢀ–ꢀ
3.23 (m, 2H), 2.55
ꢀ–ꢀ
2.51 (m, 2H), 2.10 (s, 4H).
13
C NMR (125 MHz, DMSO
‑
d6) δ 167.75, 152.47, 147.20, 134.29, 127.27, 126.28, 125.34, 124.99, 124.78, 122.87, 122.64, 118.05, 114.30, 66.22, 53.19, 52.25, 48.21. HR
‑
MS (m/z): calculated for C
24
H
17
N3O4S
2 [M+H]+
, 419.1212; found, 419.1190.其1H NMR图谱如图4，
13
C NMR图谱如图5，HR
‑
MS图谱如图6。
[0017]实施例2 所制备的荧光探针对pH值的响应预先准备7份浓度为20
ꢀµ
M的探针缓冲溶液，然后分别向pH值为4，5，6，7，7.4，8，9的PBS水溶液中加入探针缓冲溶液，然后进行荧光检测。在λex= 365 nm照射时，最大发射波长由621 nm蓝移至555 nm可通过肉眼本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种可通过颜色指示pH值的荧光探针，其化学结构式如式1所示：式 1化学结构式。2.一种如权利要求1所述的荧光探针的制备方法，其特征在于以下几个步骤：（1）将2
‑
（N
‑
吗啉代）乙烷磺酸加入至无水二氯甲烷溶液/三氯甲烷/氯仿/二氯乙烷中、再滴加草酰氯和二甲基甲酰胺，在氮气保护下，冰水浴中充分搅拌，反应完全后，过滤除去滤渣并浓缩滤液，可得化合物2；（2）取化合物3溶解在无水二氯甲烷/三氯甲烷/氯仿/二氯乙烷中，加入一定量三乙胺溶液；将混合物冷却至0 ℃，逐滴添加...

【专利技术属性】
技术研发人员：ꢀ五一IntClC零七D二七七六六，
申请(专利权)人：湖南超亟检测技术有限责任公司，
类型：发明
国别省市：