氧-甲基转移酶PgmB在催化大黄素产生大黄素甲醚中的应用制造技术

本发明专利技术公开了氧

【技术实现步骤摘要】
氧
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甲基转移酶PgmB在催化大黄素产生大黄素甲醚中的应用


[0001]本专利技术属于酶基因工程及酶工程领域，具体涉及一种来源于土曲霉(Aspergillus terreus)的氧
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甲基转移酶PgmB在催化大黄素产生大黄素甲醚中的应用。

技术介绍

[0002]大黄素甲醚是一种以蒽醌为碳骨架的芳香聚酮化合物。研究表明，大黄素甲醚对白粉病、灰霉病、稻瘟病、丝核菌等10余种重要病原菌有杀菌活性，因此常被用作农用杀菌剂，其作用机制是通过抑制病原菌的糖及糖代谢中间产物的氧化、脱氢，抑制蛋白质和核酸的合成，从而抑制病原菌孢子萌发、菌丝的生长、吸器的形成，使得作物免受病原菌的侵害达到防病的效果。作为一种高效低毒新型绿色环保植物源农药，大黄素甲醚具有降解快、低残留、不易产生抗药性、有效促进作物新梢新芽生长、基本无施药采收间隔期等优势，特别适合作为有机蔬菜生产的绿色生物制剂。
[0003]目前生产大黄素甲醚的方法主要是植物提取法和内源真菌发酵法。大黄素甲醚从植物中提取和纯化过程复杂、化学合成产量低，而真菌生产菌株大部分又难以培养、致病性或产率低，从根本上限制了通过原始生产菌株发酵生产化合物的规模。随着基因组测序技术的发展，在模式微生物中开发的许多合成生物学策略，已经成为聚酮化合物的发现、表征、生产和酶功能鉴定的有用工具。在模式微生物中异源合成植物源天然产物的新思路将大幅降低大黄素甲醚等生物农药的生产成本，进一步促进其推广应用。迄今为止，已有研究人员在酿酒酵母中重构大黄素的生物合成路径，但大黄素甲醚的路径仍未建立。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供氧
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甲基转移酶PgmB在催化大黄素产生大黄素甲醚中的应用。
[0005]本专利技术的技术方案概述如下：
[0006]氧
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甲基转移酶PgmB在催化大黄素产生大黄素甲醚中的应用，其特征是所述氧
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甲基转移酶PgmB的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0007]本专利技术的优点：
[0008]实验证明，氧
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甲基转移酶PgmB可以以大黄素为底物生成大黄素甲醚，降低大黄素甲醚生产成本，为实现大黄素甲醚的异源生物合成奠定基础。
附图说明
[0009]图1为含有PgmB基因的大肠杆菌BL21转化子菌落PCR验证的DNA琼脂糖凝胶图谱(目的条带大小为1283bp)；M：标准DNA分子尺；泳道1：PgmB；
[0010]图2为大黄素甲醚的标准曲线；
[0011]图3为生物转化后样品溶液的HPLC图谱，其中：
[0012]A为PgmB细胞生物转化后的样品溶液的HPLC图谱；
[0013]B为HPLC检测的大黄素甲醚峰面积，(a：pET
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28a空质粒对照；b：PgmB；c：化合物1为10μg/mL的大黄素标品，化合物2为25μg/mL大黄素甲醚标品。)
具体实施方式
[0014]氧
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甲基转移酶PgmB(Accession:ARB51364.1)。
[0015]下面结合附图和实施例对本专利技术作进一步的详细说明。
[0016]实施例1.PgmB大肠杆菌BL21表达菌株的构建
[0017]一.将来源于土曲霉(Aspergillus terreus NIH2624)的氧
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甲基转移酶PgmB(氨基酸序列SEQ ID NO.1)针对大肠杆菌进行密码子优化，基因合成，构建pET28a
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pgmB重组质粒。
[0018]二.制备大肠杆菌BL21感受态，操作步骤如下：
[0019](1)从
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80℃冰箱取出大肠杆菌BL21甘油菌，置于冰上缓慢融化，吸取适量菌液接种到LB固体平板上三区划线，置于37℃培养箱12h至长出单菌落。
[0020](2)挑取新鲜的单菌落于10mL LB液体培养基进行培养，置于37℃摇床，220rpm培养约12h至对数生长期。
[0021](3)按1％的接种量，转接至50mL LB液体培养基中。37℃，220rpm摇2.5
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3h，每一小时测一次OD，当OD
600
＝0.4
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0.6时停止培养。
[0022](4)将菌液置冰上5min后分装于灭菌预冷的50mL离心管中，冰浴30min，4℃下5000rpm离心5min，弃上清。
[0023](5)向每管菌体加5mL预冷的体积浓度为10％的甘油水溶液，于冰上缓慢重悬菌体，4℃，5000rpm离心5min，弃上清，重复本步骤3次，弃上清。
[0024](6)每管菌体加入200μL体积浓度10％的甘油水溶液，将菌体混匀，使细胞悬于甘油水溶液中，分装到1.5mL EP管中，每管100μL，
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80℃存放，得到大肠杆菌BL21感受态。
[0025]三.通过电转化法将pET28a
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pgmB重组质粒转化至大肠杆菌BL21感受态，操作步骤如下：
[0026](1)从
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80℃冰箱取出制备好的大肠杆菌BL21感受态，置于冰上融化，同时将无菌的电击杯置于冰上预冷。
[0027](2)打开电转仪，调至Manual模式，调节电压设为2.5Kv，预热5min。
[0028](3)吸取5μL pET28a
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pgmB重组质粒于100μL大肠杆菌BL21感受态中，轻轻混合均匀得混合液，冰上放置10min，转入预冷的电击杯中，缓慢吹吸，使混合液进入电转杯电极之间，加盖。
[0029](4)将电击杯推入电转化仪，按pulse，电击参数约为3.5ms。
[0030](5)向电击杯迅速加入1mL LB液体培养基，轻轻吸打，并转移至1.5mL离心管中，置于37℃、180rpm复苏培养45min。
[0031](6)5000rpm，离心2min，弃上清，留100μL重悬菌液，用涂布棒将菌液涂布于含25μg/mL卡那霉素抗性的LB固体培养基上。37℃培养箱倒置过夜培养。
[0032]四.含有目标转化子单菌落的筛选
[0033]从本实施例步骤三(6)得到的固体培养基取出，随机挑选10个单菌落分别混匀于10μLddH2O中。取7μL混于100μL LB液体培养基中，置于37℃，220rpm摇床培养。剩余3μL作为
PCR模板，以SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3为上下游引物，进行菌落PCR反应，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，筛选含有目标转化子的单菌落。其中，反应体系为10μL，包括ddH2O 1.0μL，2
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Taq DNA Master Mix(1mL)5.0μL，SEQ ID NO.2所示引物(10μM)0.5μL，SEQ ID NO.3所示引物(10μM)0.5μL，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.氧
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甲基转移酶PgmB在催化大黄素产生大黄素甲醚中的应用，其特征是所述氧...

【专利技术属性】
技术研发人员：乔建军，梁冬梅，陈瑞琦，饶海密，李钰琨，
申请(专利权)人：天津大学浙江绍兴研究院，
类型：发明
国别省市：