EB病毒定量检测试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种EB病毒定量检测试剂盒，涉及生物检测技术领域。所述EB病毒定量检测试剂盒包括EB病毒核酸释放剂、PCR反应液、酶混合液、阴性对照、阳性对照、定量参考品和EB病毒内标；所述PCR反应液包括引物和探针；所述引物为：上游引物EB

【技术实现步骤摘要】
EB病毒定量检测试剂盒


[0001]本专利技术涉及生物检测
，具体涉及一种EB病毒定量检测试剂盒。

技术介绍

[0002]EB病毒(Epstein－Barr virus，EBV)为疱疹病毒科，是一种嗜人类淋巴细胞的疱疹病毒。EBV是双链DNA病毒，基因组长约172kb，在病毒颗粒中呈线性分子，进入受感染细胞后，其DNA发生环化并能自我复制。
[0003]EB病毒长期潜伏在淋巴细胞内，以环状DNA形式游离在胞浆中，并整合在染色体内。EB病毒在人群中广泛感染，主要通过唾液传播，也可经输血传染。EB病毒在口咽部上皮细胞内增殖，然后感染B淋巴细胞，这些细胞大量进入血液循环而造成全身性感染，并可长期潜伏在人体淋巴组织中，当机体免疫功能低下时，潜伏的EB病毒活化形成得复发感染。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供一种灵敏度高、重复性好的EB病毒定量检测试剂盒。
[0005]本专利技术的内容通过以下技术方案进行实现：
[0006]一种EB病毒定量检测试剂盒，包括EB病毒核酸释放剂、PCR反应液、酶混合液、阴性对照、阳性对照、定量参考品和EB病毒内标；所述 PCR反应液包括引物和探针；
[0007]所述引物为：
[0008]上游引物EB
‑
F：5'CCGTTGGTTTCAGCGCATCG 3'，
[0009]下游引物EB
‑
R：5'ACCTGTGCACCCAAGTGTCG 3'；
[0010]所述探针为：5'AGACTGCAAACCCTGGCCGC 3'，其中5'端标记有荧光基团，3'端标记有淬灭基团；
[0011]所述EB病毒内标的上游引物F：5'CCCACTGCATTGCCGAA 3'，
[0012]所述EB病毒内标的下游引物R：5'GCCCAGGAAGACATCCTT 3'；
[0013]引物和探针是通过EB病毒的基因序列中的靶基因序列进行设计的，且靶基因序列位于保守区。
[0014]进一步的，所述EB病毒核酸释放剂的成分及质量百分浓度如下：
[0015][0016]进一步的，所述PCR反应液还包括0.2～0.4mM的dNTPs、4～8mM的氯化镁和0.1M的Tris缓冲液。
[0017]进一步的，所述酶混合液包括2～6U的Taq酶和0.2～0.6U的UNG酶。
[0018]进一步的，所述定量参考品为含目的基因片段的克隆质粒。
[0019]进一步的，所述定量参考品包括：
[0020]定量参考品A：1.0
×
104copies/ml含目的基因片段的克隆质粒；
[0021]定量参考品B：1.0
×
105copies/ml含目的基因片段的克隆质粒；
[0022]定量参考品C：1.0
×
106copies/ml含目的基因片段的克隆质粒；
[0023]定量参考品D：1.0
×
107copies/ml含目的基因片段的克隆质粒。
[0024]进一步的，所述试剂盒的反应体系为50℃，2min；94℃，5min；94℃， 15s；57℃，30s；25℃，10s，一共45个循环。
[0025]本专利技术的检验原理为：首先利用EB病毒核酸释放剂快速裂解，将EB 病毒DNA给释放出来，利用针对EB病毒核酸保守区设计的一对特异性引物、一条特异性荧光探针，配备PCR反应液，然后应用TaqMan荧光探针技术实现对EB病毒DNA的快速检测。
[0026]与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
[0027]1、本专利技术所设计的引物和探针具有保守性好、特异性强的优点，可以高效的提高检测EB病毒的灵敏度和重复性；
[0028]2、本专利技术设计了高效的EB病毒内标系统，可以解决靶基因和EB病毒内标同时检测时存在的干扰问题；
[0029]3、本专利技术的试剂盒在操作过程中较为简单方便。
具体实施方式
[0030]为使本专利技术要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合具体实施例进行详细描述。
[0031]实施例1：
[0032]本实施例的EB病毒定量检测试剂盒包括EB病毒核酸释放剂、PCR 反应液、酶混合液、阴性对照、阳性对照、定量参考品和EB病毒内标，其中，
[0033]1、EB病毒核酸释放剂：包括溶菌酶质量百分浓度为2％，牛血清蛋白的质量百分浓度为3％，十二烷基硫酸钠的质量百分浓度为5％，吐温
‑
80 的质量百分浓度为1％；
[0034]2、PCR反应液：包括浓度为0.2mM的dNTPs、4mM的氯化镁、0.2μM 的引物和0.5μM的探针以及0.1M的Tris缓冲液；
[0035]引物、探针和EB病毒内标的序列号如下：
[0036]上游引物EB
‑
F：5'CCGTTGGTTTCAGCGCATCG 3'，
[0037]下游引物EB
‑
R：5'ACCTGTGCACCCAAGTGTCG 3'；
[0038]探针为：5'AGACTGCAAACCCTGGCCGC 3'，5'端标记有荧光基团， 3'端标记有淬灭基团；
[0039]EB病毒内标的上游引物F：5'CCCACTGCATTGCCGAA 3'，
[0040]EB病毒内标的下游引物R：5'GCCCAGGAAGACATCCTT 3'；
[0041]引物和探针是通过EB病毒的基因序列中的靶基因序列进行设计的，且靶基因序列位于保守区。
[0042]3、酶混合液：包括2U的Taq酶和0.2U的UNG酶；
[0043]4、阴性对照：阴性样本(已灭活)；
[0044]5、定量参考品：包括定量参考品1、定量参考品2、定量参考品3、定量参考品4；
[0045]定量参考品A：1.0
×
104copies/ml含目的基因片段的克隆质粒；
[0046]定量参考品B：1.0
×
105copies/ml含目的基因片段的克隆质粒；
[0047]定量参考品C：1.0
×
106copies/ml含目的基因片段的克隆质粒；
[0048]定量参考品D：1.0
×
107copies/ml含目的基因片段的克隆质粒。
[0049]样本的处理：
[0050](1)每个PCR反应管中加入100μL样本和等体积的浓缩液， 12000rpm离心5min，弃上清，之后加入50μL样本释放剂，用枪头挑起沉淀，吹打几次，将沉淀打散混匀，作为待测样本备用。之后在每个PCR 反应管加入阳性对照、阴性对照及定量参考品A～D各10μL，2000rpm离心30s。
[0051]PCR扩增：
[0052](1)试剂准备
[0053]a、取出试剂盒中的各组分，室温放置，待其温度本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种EB病毒定量检测试剂盒，其特征在于，包括EB病毒核酸释放剂、PCR反应液、酶混合液、阴性对照、阳性对照、定量参考品和EB病毒内标；所述PCR反应液包括引物和探针；所述引物为：上游引物EB
‑
F：5'CCGTTGGTTTCAGCGCATCG 3'，下游引物EB
‑
R：5'ACCTGTGCACCCAAGTGTCG 3'；所述探针为：5'AGACTGCAAACCCTGGCCGC 3'，其中5'端标记有荧光基团，3'端标记有淬灭基团；所述EB病毒内标的上游引物F：5'CCCACTGCATTGCCGAA 3'，所述EB病毒内标的下游引物R：5'GCCCAGGAAGACATCCTT 3'。2.根据权利要求1所述的EB病毒定量检测试剂盒，其特征在于，所述EB病毒核酸释放剂的成分及质量百分浓度如下：3.根据权利要求1所述的EB病毒定量检测试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液还包括0.2～0.4mM的dNTPs、4～8mM的氯化镁和0.1M的Tris缓冲...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢清华，李林林，胡晓飞，董雯，庄学伟，
申请(专利权)人：山东博弘基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：