一种星油藤六倍体植株的培育方法技术

本发明专利技术属于植物倍性育种领域，具体地说涉及一种星油藤六倍体植株的培育方法。所述方法包括无菌培养条件下用星油藤种子的胚乳诱导愈伤组织、游离原生质体并分选出三倍体原生质体、利用秋水仙素诱导三倍体原生质体加倍成六倍体、游离原生质体并分选出六倍体原生质体、将六倍体原生质体诱导培养形成六倍体植株的过程。本发明专利技术的优点在于原生质体阶段即可进行筛选，方法快速、高效、诱导率高，获得的多倍体材料能够通过增殖培养获得大量六倍体试管苗，极大地缩短了育种进程。极大地缩短了育种进程。

【技术实现步骤摘要】
一种星油藤六倍体植株的培育方法


[0001]本专利技术涉及作物倍性育种
，具体地说，公开了一种星油藤六倍体植株的培育方法。

技术介绍

[0002]星油藤(Plukenetia volubilis L.)又称为南美油藤、印加果和印加花生等，为大戟科(Euphorbiaceae)多年生木质藤本油料植物，主要利用部位是种子，富含油脂、氨基酸、维生素等，其中油脂主要是由α
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亚麻酸、α
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亚油酸和油酸等多元不饱和脂肪酸组成，三种不饱和脂肪酸含量占90％以上，显著高于花生、油菜、油茶等油料植物，尤其是α
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亚麻酸这种人体必需脂肪酸的含量占油脂成分的45～53％，因此被认为是一种高端植物食用油，在食品、药品以及化妆品等领域具有广阔的应用前景。
[0003]星油藤于2006年引入我国后，在云南、贵州等省区进行引种栽培并获得成功。星油藤具有周期短、见效快、丰产性能好、可在山区和丘陵地区种植等特点。另外，星油藤当年种植，当年开花结果，一次种植后可连续收益多年，产值较高，是一种具有广阔发展前景的经济作物。但是星油藤为新引进物种，种质资源缺乏，制约了良种选育，不利于星油藤产业发展。植物多倍体化后花、果等生殖器官变大，次生代谢物含量提高，因此培育多倍体星油藤可能是提高星油藤油脂产量的途径之一。因此，本专利技术分开了一种星油藤六倍体植株的培育方法，具有操作性强、效率高、成本低、周期短等特点，可为促进星油藤多倍体育种，培育高油的星油藤新品种奠定基础。

技术实现思路
/>[0004]本专利技术的目的在于提供一种星油藤六倍体植株的培育方法，本专利技术利用胚乳为三倍体的特点，并结合秋水仙碱能使染色体加倍的生物效应，通过组织培养培养，快速、高效获得星油藤六倍体植株，从而实现了本专利技术的目的。
[0005]本专利技术的一种星油藤六倍体植株的培育方法，包括以下的工艺步骤：
[0006](1)胚乳愈伤诱导：无菌条件下，星油藤种子常规消毒处理后，去除种皮，将胚及胚乳接种在愈伤组织诱导培养基中，在黑暗条件下培养30d后，剥离胚，胚乳继续培养诱导胚乳愈伤组织，所述的愈伤组织诱导培养基为MS+1.0～3.0mg/L 6
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BA+0.5～2.0mg/L NAA+0.5～1.0g/L水解酪蛋白+0.5～1.0g/L吗啉乙磺酸+15～30g/L蔗糖+3.5～6.0g/L琼脂，pH为5.4～5.8；
[0007](2)原生质体游离及分选：将胚乳愈伤组织置于4℃条件下黑暗处理24h后，用愈伤组织酶解液处理5～10h游离原生质体，然后用活体DNA染色剂(5～10μg/ml Hoechst 33342)染色3～5min，在无菌条件下利用流式细胞仪筛选三倍体细胞，使其得到富集。所述的愈伤组织酶解液包括细胞壁水解酶和原生质体洗涤液，其中细胞壁水解酶为1.0～2.0％纤维素酶+0.5～1.0％离析酶+0.5～1.0％果胶酶，原生质体洗涤液为20～25mg/L KH2PO4+90～100mg/L KNO3+180～240mg/L MgSO4·
H2O+0.1～0.2mg/L KI+0.01～0.02mg/L CuSO4+
1.0～1.5g/L CaCl2·
H2O+0.5～0.8mol/L甘露醇+10～20μmol/L吗啉乙磺酸，pH为5.4～5.8；
[0008](3)六倍体愈伤组织诱导及分选：将分选所得的三倍体原生质体置于六倍体愈伤组织诱导培养基中，黑暗条件下25℃轻柔震荡培养直至形成愈伤组织块后，将其转接至愈伤组织诱导培养中培养获得愈伤组织，并按步骤(2)进行原生质体游离，分选出六倍体原生质体。所述的六倍体愈伤组织诱导培养基为MS+1.0～3.0mg/L 6
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BA+0.5～2.0mg/L NAA+1.0～2.0g/L秋水仙碱+0.5～1.0g/L水解酪蛋白+0.5～1.0g/L吗啉乙磺酸+0.5～0.8mol/L甘露醇+15～30g/L蔗糖+3.5～6.0g/L琼脂，pH为5.4～5.8；
[0009](4)六倍体原生质体培养形成愈伤组织：将分选所得的六倍体原生质体置于含有0.5～0.8mol/L甘露醇的愈伤组织诱导培养基中，黑暗条件下25℃轻柔震荡培养直至形成愈伤组织块后，将其转接至愈伤组织诱导培养中于在25℃，光照强度为40μmol
·
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‑2·
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‑1条件下培养获得愈伤组织。
[0010](5)六倍体愈伤组织诱导形成不定芽：将愈伤组织接种于芽分化培养基中进行芽分化培养获得不定芽。所述的芽分化培养基为：MS+0.5～1.0mg/L 6
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BA+0.1～0.5mg/L NAA+15～30g/L蔗糖+3.5～6.0g/L琼脂，pH为5.4～5.8；
[0011](6)不定芽诱导生根形成六倍体幼苗：将不定芽接种于生根培养基中进行生根培养获得星油藤六倍体幼苗。所述生根培养基为1/2MS+0.1～0.5mg/L IBA+1.0～2.0mg/L GGR+15～30g/L蔗糖+3.5～6.0g/L琼脂，pH为5.4～5.8；
[0012](7)栽培：将星油藤六倍体幼苗根部的培养清洗干净后，栽培于混合基质中栽培成苗即得星油藤六倍体种苗。所述混合基质为由比例8:1:1的泥炭土、农家肥、河沙混合而成的基质。
[0013]本专利技术综合利用胚乳培养、染色体加倍技术培育星油藤六倍体植株，具有操作性强、效率高、成本低、周期短等特点。
具体实施方式
[0014]以下实施例是对本专利技术的进一步说明，不是对本专利技术的限制。
[0015]实施例一
[0016]星油藤胚乳诱导愈伤组织
[0017]在8月下旬我采集成熟的星油藤(Plukenetia volubilis L.)种子，去除假种皮，无菌条件下，星油藤种子常规消毒方法处理后，去除种皮，将胚及胚乳接种在愈伤组织诱导培养基中，在黑暗条件下培养30d后，剥离胚，胚乳继续培养诱导胚乳愈伤组织，愈伤组织诱导率可达75.8％以上。
[0018]实施例二
[0019]星油藤愈伤组织游离原生质体
[0020]星油藤(Plukenetia volubilis L.)愈伤组织，选取淡黄色的愈伤组织，于4℃条件下黑暗处理24h后，在无菌条件下称取0.5g愈伤组织，并置于含有10ml酶解液的50ml离心管内，以封口膜封口，于25℃黑暗条件下处理5～10h，每隔1h轻柔颠倒混匀一次。酶处理后，以300目细胞筛过滤，滤液置于新的无菌离心管内并以封口膜封口，以100g低温离心3min。吸弃上清液后，加入原生质体洗涤液重悬，吸弃
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重悬重复3次。将悬浮液定容至500ml，取少
许悬浮液，用0.03％的台盼蓝染色3min后，滴加至细胞计数板上，在显微镜观察和统计原生质体游离个数及存活率。结果表明，1g星油藤愈伤组织可游离出2.5*106个原生质体，存活率达到90％以上。
[0021]本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种星油藤六倍体植株的培育方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)胚乳愈伤诱导：无菌条件下，星油藤种子常规消毒处理后，去除种皮，将胚及胚乳接种在愈伤组织诱导培养基中，黑暗条件下培养30d后，剥离胚，胚乳继续培养诱导胚乳愈伤组织，所述的愈伤组织诱导培养基为MS+1.0～3.0mg/L 6
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BA+0.5～2.0mg/L NAA+0.5～1.0g/L水解酪蛋白+0.5～1.0g/L吗啉乙磺酸+15～30g/L蔗糖+3.5～6.0g/L琼脂，pH为5.4～5.8；(2)原生质体游离及分选：将胚乳愈伤组织置于4℃条件下黑暗处理24h后，用愈伤组织酶解液处理5～10h游离原生质体，然后用活体DNA染色剂(5～10μg/ml Hoechst 33342)染色3～5min，在无菌条件下利用流式细胞仪筛选三倍体细胞，使其得到富集；所述的愈伤组织酶解液包括细胞壁水解酶和原生质体洗涤液，其中细胞壁水解酶为1.0～2.0％纤维素酶+0.5～1.0％离析酶+0.5～1.0％果胶酶，原生质体洗涤液为20～25mg/L KH2PO4+90～100mg/L KNO3+180～240mg/L MgSO4·
H2O+0.1～0.2mg/L KI+0.01～0.02mg/L CuSO4+1.0～1.5g/L CaCl2·
H2O+0.5～0.8mol/L甘露醇+10～20μmol/L吗啉乙磺酸，pH为5.4～5.8；(3)六倍体愈伤组织诱导及分选：将分选所得的三倍体原生质体置于六倍体愈伤组织诱导培养基中，黑暗条件下25℃轻柔震荡培养直至形成愈伤组织块后，将其转接至愈伤组织诱导培养中培养获得愈伤组织，并按步...

【专利技术属性】
技术研发人员：韦敏，梁钧淞，朱格格，李彩凤，何钦霞，陈彤，吴敏裕，宁孟，方源，
申请(专利权)人：玉林师范学院，
类型：发明
国别省市：