一种制造技术

本发明专利技术公开了一种

【技术实现步骤摘要】
一种
‘
秋月梨
’
愈伤组织的诱导方法及应用方法


[0001]本专利技术属于植物组织培养
，具体涉及一种
‘
秋月梨
’
花药愈伤的诱导方法及应用。

技术介绍

[0002]‘
秋月梨
’
为蔷薇科梨属栽培品种，是用162
‑
29（新高
×
丰水）
×
幸水杂交育成的中晚熟褐色砂梨新品种。
‘
秋月梨
’
抗寒力强，耐干旱；果实略呈扁形，果形端正，果皮黄褐色，果肉乳白色，果核小，可食率95%以上。其肉质细脆，汁多味甜，清香爽口，石细胞极少，品质极优，具有研究价值。同时，在植物分子遗传研究中，构建愈伤组织再生系统相较于其他再生方式，试材更易于接受外源基因、转化率高、扩繁量大。但是在获取
‘
秋月梨
’
愈伤组织的过程中，发现利用茎、叶等外植体诱导时，会出现褐变现象而难以成功诱导出愈伤组织，因此，针对
‘
秋月梨
’
这种新品种，如何获取其愈伤组织以便进行更有效的研究和应用，是本领域急需解决的技术问题。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的之一是提供一种
‘
秋月梨
’
愈伤组织的诱导方法，该方法采用
‘
秋月梨
’
的花药为外植体在特定培养基中进行诱导和增殖，顺利得到了
‘
秋月梨<br/>’
的花药愈伤组织。
[0004]为实现上述目的，本专利技术采取以下技术方案：一种
‘
秋月梨
’
愈伤组织的诱导方法，包括如下步骤：步骤S10：采集
‘
秋月梨
’
的花蕾，在3~5℃下放置3~5天；步骤S20：将放置后的所述花蕾清洗和消毒，然后将花蕾中的花药取出，接种到诱导培养基上暗培养30~50天，获得花药愈伤组织，所述诱导培养基为：1/2MS+19~21 g/L蔗糖+1.3~1.7 mg/L 2,4
‑
D+0.8~1.2 mg/L 6
‑
BA+6~8 g/L琼脂，pH 5.8~6.2；步骤S30：将诱导出的花药愈伤组织接种增殖培养基中进行增殖培养，从而获得愈伤组织，所述增殖培养基为：1/2MS+19~21 g/L蔗糖+0.8~1.2 mg/L 2,4
‑
D+0.8~1.2 mg/L 6
‑
BA+6~8 g/L琼脂，pH 5.8~6.2。
[0005]优选的，所述诱导培养基为1/2MS+20 g/L蔗糖+1.5 mg/L 2,4
‑
D+1.0 mg/L 6
‑
BA+7 g/L琼脂，pH 5.8~6.2；所述增殖培养基为1/2MS+20 g/L蔗糖+1.0 mg/L 2,4
‑
D+1.0 mg/L 6
‑
BA+7 g/L琼脂，pH 5.8~6.2。
[0006]优选的，在步骤S20中，所述清洗为用无菌水洗3~5遍，去掉花蕾表面的灰尘；所述消毒为使用质量分数75％的酒精浸泡清洗后的花蕾30 s，然后再用质量分数0.1％HgCl2处理8~10 min，无菌水清洗3~5次后用无菌滤纸吸干花蕾表面水分。
[0007]优选的，在步骤S20中，所述暗培养的温度为25
±
2℃。
[0008]优选的，在步骤S30中，所述增殖培养在暗环境中进行，培养温度为25
±
2℃，每30~40天进行一次继代。
5.8~6.2。培养40天后进行一次继代，继续培养40天获得新的愈伤组织（图4）。
[0024]使用携带外源基因（商业化载体pEGFP）的根癌农杆菌的重悬液浸泡愈伤组织并微微摇晃；浸泡侵染时间10 min，重悬液中乙酰丁香酮（AS）工作浓度200 μmol/L。侵染处理后的愈伤组织接种到共培养培养基中25
±
2℃暗培养3天（图5）。共培养培养基为：1/2MS+20 g/L蔗糖+1.0 mg/L 2 ,4
‑
D+1.0 mg/L 6
‑
BA+7 g/L琼脂，pH 5.8~6.2。
[0025]共培养结束后使用脱菌液洗涤2次，无菌水洗涤3次，在无菌滤纸上吸干水分后转移到筛选培养基中筛选（图6），得到抗性愈伤组织。脱菌液为：1/2MS+20 g/L蔗糖+300 mg/L头孢霉素。筛选培养基为：1/2MS+20 g/L蔗糖+1.0 mg/L 2 ,4
‑
D+1.0 mg/L 6
‑
BA+300 mg/L头孢霉素+6 mg/L潮霉素+7 g/L琼脂。
[0026]本实施例只是对本专利技术构思和实现的说明，并非对其进行限制，在本专利技术构思下，未经实质变换的技术方案仍然在保护范围内。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种
‘
秋月梨
’
愈伤组织的诱导方法，其特征在于包括如下步骤：步骤S10：采集
‘
秋月梨
’
的花蕾，在3~5℃下放置3~5天；步骤S20：将放置后的所述花蕾清洗和消毒，然后将花蕾中的花药取出，接种到诱导培养基上暗培养30~50天，获得花药愈伤组织，所述诱导培养基为：1/2MS+19~21 g/L蔗糖+1.3~1.7 mg/L 2,4
‑
D+0.8~1.2 mg/L 6
‑
BA+6~8 g/L琼脂，pH 5.8~6.2；步骤S30：将诱导出的花药愈伤组织接种增殖培养基中进行增殖培养，从而获得愈伤组织，所述增殖培养基为：1/2MS+19~21 g/L蔗糖+0.8~1.2 mg/L 2,4
‑
D+0.8~1.2 mg/L 6
‑
BA+6~8 g/L琼脂，pH 5.8~6.2。2.如权利要求1所述的
‘
秋月梨
’
愈伤组织的诱导方法，其特征在于，所述诱导培养基为1/2MS+20 g/L蔗糖+1.5 mg/L 2,4
‑
D+1.0 mg/L 6
‑
BA+7 g/L琼脂，pH 5.8~6.2；所述增殖培养基为1/2MS+20 g/L蔗糖+1.0 mg/L 2,4
‑
D+1.0 mg/L 6
‑
BA+7 g/L琼脂，pH 5.8~6.2。3.如权利要求1所述的
‘
秋月梨
’
愈伤组织的诱导方法，其特征在于，在所述步骤S20中，所述清洗为用无菌水洗3~5遍，去掉花蕾表面的灰尘；所述消毒为使用质量分数75％的酒精浸泡清洗后的花蕾30 s，然后再用质量分数0.1％HgCl2处理8~10 min，无菌水清洗3~5次后用无菌滤纸吸干花蕾表面水分。4.如权利要求1所述的
‘
秋月梨
’
愈伤组织的诱导方法，其特征在于，在步骤S20中，所述暗培养...

【专利技术属性】
技术研发人员：石海燕，徐悦，霍利月，李晓娜，杨雄，
申请(专利权)人：河北农业大学，
类型：发明
国别省市：