一种筛选适配体的方法技术

本发明专利技术公开了一种筛选适配体的方法，该筛选方法包括如下步骤：1)将随机序列插入到自裂酶中，使自裂酶失去自我剪切功能；2)随机序列与靶标分子结合，自裂酶自我剪切功能恢复，发生自我剪切；3)通过对发生剪切的序列重复分离与筛选富集到能感应靶标分子的适配体。本发明专利技术利用酶自我剪切的特性可以达到精准分离与小分子结合并发生剪切的序列，简化了复杂的实验设计，提供了一种便捷的分离筛选方法。提供了一种便捷的分离筛选方法。

【技术实现步骤摘要】
一种筛选适配体的方法


[0001]本专利技术涉及一种基于DNA自裂酶的SELEX用于筛选适配体的方法。

技术介绍

[0002]SELEX技术实际上是一个筛选过程，起始于庞大的随机核酸序列库。从理论上讲，该文库包含两个固定端，可以进行PCR扩增，中间有一个随机区域，通常为40个核苷酸，这就产生了440个不同序列的理论文库，然后将这种含有大约1015个不同的分子的随机文库与靶物质一起孵育，然后分离与靶物质结合的核酸分子，再经过PCR扩增与靶物质结合的DNA。重复此过程，直到分离出对靶物质具有高亲和力的DNA池为止。然后对该池进行测序和表征，以鉴定具有最高亲和力的适体。SELEX策略已被用于鉴定从小分子到多肽等各种靶标的适配体。尽管通用的SELEX方法已被广泛使用，但仍然有许多高级的SELEX方法被开发出来，改善和加快了筛选过程。例如，传统的SELEX使用纯蛋白作为体外选择的靶标，但是纯蛋白的三维结构可能与细胞表面的三维结构不同，所以开发了基于细胞的SELEX来解决该问题。同时cell
‑
SELEX也扩大了适配体在疾病诊断和预后中的应用。传统的SELEX过程繁琐，昂贵且耗时，因此提出了新的SELEX技术来简化程序和提高选择效率。

技术实现思路

[0003]本专利技术的主要目的，在于提供一种筛选适配体的方法。
[0004]本专利技术解决其技术问题的所采用的技术方案是：
[0005]一种筛选适配体的方法，包括如下步骤：
[0006]1)将随机序列插入到自裂酶中，使自裂酶失去自我剪切功能；
[0007]2)随机序列与靶标分子结合，自裂酶自我剪切功能恢复，发生自我剪切；
[0008]3)通过对发生剪切的序列重复分离与筛选富集到能感应靶标分子的适配体。
[0009]本专利技术技术方案与
技术介绍
相比，具有如下优点：
[0010]利用酶自我剪切的特性可以达到精准分离与小分子结合并发生剪切的序列，简化了复杂的实验设计。
附图说明
[0011]下面结合附图和实施例对本专利技术作进一步说明。
[0012]图1为自建库序列信息。
[0013]图2为空切。Marker为公司订购的113nt和86nt的ssDNA，Template为L
‑
别异亮氨酸与Zn2+共同孵育后发生剪切后的剪切片段，片段长度为86nt。比对86ntmarker把空胶切下，进行逐步的富集.。
[0014]图3为I
‑
R3
‑
random文库RI扩增。纯化后的剪切产物经过第一对引物扩增30个循环的PCR产物，产物长度为98bp。
[0015]图4为I
‑
R3
‑
random文库RI扩增。纯化后98bp的产物经过第二对引物扩增得到全长
113bp的双链DNA。
[0016]图5为不对称PCR方法拆分双链DNA。产物1
‑
6是相同条件下拆分单链的结果，是为了制备丰富的下一轮单链DNA文库。
[0017]图6为I
‑
R3
‑
random筛选结果。第五轮筛选后在第86nt处出现了一个明显的条带。Marker为在公司订购的113nt与86nt的ssDNA。
[0018]图7为空切。Marker为公司订购的95nt的ssDNA，Clv product为L
‑
别异亮氨酸与Zn2+共同孵育后发生剪切后的剪切片段，片段长度为95nt。比对95nt marker把空胶切下，进行逐步的富集。
[0019]图8为用5
’
生物素化的上游引物扩增出全长108bp
[0020]图9为适配体富集的DNA条带。A.第7轮DNA条带；B.第9轮DNA条带；C.第12轮DNA条带。
[0021]图10为IR3
‑
I
‑
DNA适配体与L
‑
别异构亮氨酸结合特异性结果。(a)IR3
‑
I
‑
DNA的序列和二级结构。(b)通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)凝胶分离裂解产物。DNA切割的比例是5'和3'切割产物的条带强度除以总DNA的条带强度。前体(Pre)、5'切割产物(5'Clv)、3'切割产物(3'Clv)。(c)配体L
‑
异亮氨酸、异亮氨酸和亮氨酸的结构。Allo
‑
iso
‑
leu、iso
‑
leu和leu代表配体L
‑
allo
‑
isoleucine、isoleucine和leucine。
[0022]以上所述，仅为本专利技术较佳实施例而已，故不能依此限定本专利技术实施的范围，即依本专利技术专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本专利技术涵盖的范围内。
具体实施方式
[0023]在本专利技术中，能使用的自裂酶种类包括DNA断裂型脱氧核酶或RNA断裂型脱氧核酶。其中，DNA断裂型脱氧核酶包括类手枪脱氧核酶(pist0l
‑
like DNAzyme,PLDz),9NL27,I
‑
R3,等。
[0024]RNA断裂型脱氧核酶的种类包括Ag10x,PSCu10,8N
‑
Cd16,GR5,PbE22,Lu12,C313d以及Tm7等。
[0025]优选地，随机序列的长度为10
‑
100个碱基。进一步优选，随机序列的长度为40
‑
70个碱基。
[0026]优选地，随机文库单链DNA分子数目达到1
×
10
15
以上，保证随机文库的丰富度。优选地，随机文库单链DNA分子数目1
×
10
15
‑1×
10
18
。
[0027]优选地，步骤2)中，是在含有金属离子的缓冲溶液中发生自我剪切。
[0028]优选地，在步骤2)之前，先用含金属离子的缓冲液的孵育筛选去除随机文库中已经形成剪切结构的序列。
[0029]优选地，步骤3)中，通过不对称PCR和链霉素磁珠法将双链DNA拆分成单链的DNA文库，再用含生物素的寡核苷酸序列将其固定进入下一轮筛选，通过多次循环筛选和扩增达到富集的目的。
[0030]实施例1
[0031]将随机序列插入具有自我剪切功能的DNA自裂酶的非剪切功能部分，破坏其原有的剪切二级结构，在靶分子的作用下使随机序列形成特定二级结构，使DNA自裂酶恢复剪切结构后发生剪切。所述的随机文库为：
[0032]I
‑
R3
‑
random:5
’‑
GTAACGTAGTTGAGCTG
‑
N60
‑
TGACGTTGAAGCGTTACGCAGCTGTGGGTTGATTCC本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种筛选适配体的方法，包括如下步骤：1)将随机序列插入到自裂酶中，使自裂酶失去自我剪切功能；2)随机序列与靶标分子结合，自裂酶自我剪切功能恢复，发生自我剪切；3)通过对发生剪切的序列重复分离与筛选富集到能感应靶标分子的适配体。2.根据权利要求1所述的一种筛选适配体的方法，其特征在于：所述的自裂酶种类包括DNA断裂型脱氧核酶或RNA断裂型脱氧核酶。3.根据权利要求2所述的一种筛选适配体的方法，其特征在于：DNA断裂型脱氧核酶包括类手枪脱氧核酶,9NL27或I
‑
R3；RNA断裂型脱氧核酶的种类包括Ag10x,PSCu10,8N
‑
Cd16,GR5,PbE22,Lu12,C313d或Tm7。4.根据权利要求1所述的一种筛选适配体的方法，其特征在于：随机序列的长度为10
‑
100个碱基。5.根据权利要求4所述的一种筛选适配体的方法，其特征在于：随机序列的长度为40
‑
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【专利技术属性】
技术研发人员：李三暑，敖雅琪，
申请(专利权)人：华侨大学，
类型：发明
国别省市：