用于制备用于单分子表征的核酸构建体的方法和系统技术方案

一种制备用于单分子表征的核酸构建体的方法，所述方法包括使靶多核苷酸与以下接触：多核苷酸引导的效应蛋白；引导多核苷酸；转座酶；以及包括经修饰的多核苷酸的可转座元件，其中所述多核苷酸引导的效应蛋白将所述转座酶引导到所述靶多核苷酸内的所关注区域，并且所述转座酶将所述可转座元件插入到所述多核苷酸中，由此产生用于单分子表征的核酸构建体。体。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于制备用于单分子表征的核酸构建体的方法和系统


[0001]本专利技术涉及用于制备用于单分子表征的核酸构建体的方法和系统。

技术介绍

[0002]当前在广泛的应用范围内需要快速且便宜的多核苷酸(例如，DNA或RNA)测序和鉴定技术。现有技术缓慢且昂贵，主要是因为它们依赖于扩增技术来产生大量多核苷酸并且需要大量用于信号检测的专用荧光化学品。
[0003]跨膜孔(纳米孔)作为聚合物和各种小分子的直接电子生物传感器具有巨大的潜力。具体地，最近关注作为潜在的DNA测序技术的纳米孔。
[0004]当跨纳米孔施加电势时，当如核苷酸等分析物在桶中暂时停留一段时间时，电流会发生变化。纳米孔检测核苷酸给出已知特征和持续时间的电流变化。在链测序方法中，使单个多核苷酸链通过孔并且衍生出核苷酸的同一性。链测序可以涉及使用分子制动器来控制移动所述多核苷酸通过孔。
[0005]有许多商业情况，包含多核苷酸测序和鉴定技术，都需要制备核酸文库。这可以使用转座酶来实现。

技术实现思路

[0006]本专利技术人已经鉴定了用于制备用于单分子表征的核酸构建体的新型方法，例如通过纳米孔测序。在所述方法中，使用多核苷酸引导的效应蛋白(PGEP)将转座酶引导到靶多核苷酸内的所关注区域。在此类方向上，转座酶与包括多核苷酸(如经修饰的多核苷酸)的可转座元件相互作用，以介导将底物插入到所关注区域。以此方式，可以将有利于单分子表征的经修饰的多核苷酸引入到靶多核苷酸以促进其表征。
[0007]本专利技术人已经证明PGEP和转座酶可以以多种方式相互作用，并且此外，可以操纵这种相互作用以调节转座酶的活性。以此方式，可以提高插入的准确性，并且使脱靶转座酶活性最小化。
[0008]因此，提供了一种制备用于单分子表征的核酸构建体的方法，所述方法包括使靶多核苷酸与以下接触：
[0009]多核苷酸引导的效应蛋白；
[0010]引导多核苷酸；
[0011]转座酶；以及
[0012]包括经修饰的多核苷酸的可转座元件，
[0013]其中所述多核苷酸引导的效应蛋白将所述转座酶引导到所述靶多核苷酸内的所关注区域，并且所述转座酶将所述可转座元件插入到所述多核苷酸中，由此产生用于单分子表征的核酸构建体。
[0014]还提供了一种制备核酸构建体的方法，所述方法包括使靶多核苷酸与以下接触：
[0015]多核苷酸引导的效应蛋白；
[0016]引导多核苷酸；
[0017]转座酶；以及
[0018]可转座元件，
[0019]其中所述多核苷酸引导的效应蛋白和所述转座酶通过连接子部分在基因上融合或连接，使得所述转座酶被引导到所述靶多核苷酸内的所关注区域，并且将所述可转座元件插入到所述靶多核苷酸中，由此制备核酸构建体。
[0020]还提供了一种用于制备用于单分子表征的核酸构建体的系统，所述系统包括：
[0021]多核苷酸引导的效应蛋白；
[0022]引导多核苷酸；
[0023]转座酶；以及
[0024]包括经修饰的多核苷酸的可转座元件，
[0025]其中所述多核苷酸引导的效应蛋白将所述转座酶引导到所述靶多核苷酸内的所关注区域，并且进一步其中所述转座酶将所述可转座元件插入到所述多核苷酸中，由此产生用于单分子表征的核酸构建体。
[0026]还提供了一种用于制备核酸构建体的系统，所述系统包括：
[0027]多核苷酸引导的效应蛋白；
[0028]引导多核苷酸；
[0029]转座酶；以及
[0030]可转座元件，
[0031]其中所述多核苷酸引导的效应蛋白和所述转座酶通过连接子部分在基因上融合或连接，使得所述转座酶被引导到所述靶多核苷酸内的所关注区域，并且将所述可转座元件插入到所述靶多核苷酸中，由此制备核酸构建体。
[0032]还提供了一种检测和/或表征样品中的靶多核苷酸的方法，所述方法包括：
[0033](i)根据权利要求1到27中任一项所述的方法制备用于单分子表征的核酸构建体；
[0034](ii)使所述核酸构建体与包括跨膜孔的膜接触；
[0035](iii)跨所述膜施加电位差；以及
[0036](iv)进行由所述核酸构建体与所述孔接触产生的一种或多种测量，由此检测和/或表征所述靶多核苷酸以确定所述靶多核苷酸的存在或不存在和/或所述靶多核苷酸的一个或多个特性。
附图说明
[0037]应理解的是，附图仅用于说明本专利技术的具体实施例而并不旨在是限制性的。
[0038]图1示意性地示出了Cas9酶A，与结合的tracrRNA B和crRNA C，可以如何用于结合含有原间隔子相邻基序(PAM)E的靶dsDNA分子D，并且与Cas9结合或连接的转座子蛋白复合物可以将dsDNA标签插入在dsDNA分子中。Cas9可以连接到一个或多个转座子蛋白，如MuA或Tn5 F。在此实例中，Cas9与转座子蛋白之间的连接G发生在Cas9 tracrRNA B与转座子标签链H之一之间。此类连接也是可能的在Cas9 crRNA C与转座子标签链H之间。转座子标签链J和H可以含有用于点击测序衔接子的5'DBCO基团。tracrRNA和crRNA可以通过用发夹将两者连接成单引导RNA(sgRNA)分子。转座子蛋白将顶部和底部转座子链插入到分子中，从而使
用两个带有转座子标签链的标记dsDNA片段K和L有效地切割分子。
[0039]图2示意性地示出了Cas9酶A，与结合的tracrRNA B和crRNA C，可以如何用于结合含有原间隔子相邻基序(PAM)E的靶dsDNA分子D，并且与Cas9连接的转座子蛋白复合物可以将dsDNA货物插入在dsDNA分子中。在此实例中，Cas9通过蛋白质连接子H与多种转座子蛋白F之一融合。转座子与由插入序列J和两个衔接子序列K组成的dsDNA货物结合。Cas9与转座子蛋白之间的连接也可能在Cas9 crRNA C或tracrRNA与转座子标签链K之间。tracrRNA和crRNA可以通过用发夹将两者连接成单引导RNA(sgRNA)分子。转座子蛋白将dsDNA货物插入到dsDNA分子中，形成可以用于下游应用(如图18中所描述的那些)的分子M。
[0040]图3示意性地示出了Cas12k酶A，与结合的tracrRNA B和crRNA C，可以如何用于结合含有原间隔子相邻基序(PAM)E的靶dsDNA分子D。Cas12k结合转座子蛋白TniQ F，后者进而与转座子蛋白H和G结合。转座子与由插入序列J和插入序列上游(LE位点)K和下游(RE位点)L的两个衔接子序列组成的dsDNA货物结合。tracrRNA和crRNA可以通过用发夹将两者连接成单引导RNA(sgRNA)分子。转座子蛋白将dsDNA货物插入到的分子中，因此形成可以用于下游应用(如图18中所描述的那些)的分子M。
[0041]图4示意性地示出了Cas12k酶A，与结合的tracrRNA 本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种制备用于单分子表征的核酸构建体的方法，所述方法包括使靶多核苷酸与以下接触：多核苷酸引导的效应蛋白；引导多核苷酸；转座酶；以及包括经修饰的多核苷酸的可转座元件，其中所述多核苷酸引导的效应蛋白将所述转座酶引导到所述靶多核苷酸内的所关注区域，并且所述转座酶将所述可转座元件插入到所述多核苷酸中，由此产生用于单分子表征的核酸构建体。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述多核苷酸引导的效应蛋白通过蛋白质
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蛋白质相互作用与所述转座酶结合。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述多核苷酸引导的效应蛋白在基因上与所述转座酶融合。4.根据权利要求1所述的方法，其中所述多核苷酸引导的效应蛋白通过连接子部分连接到所述转座酶。5.一种制备核酸构建体的方法，所述方法包括使靶多核苷酸与以下接触：多核苷酸引导的效应蛋白；引导多核苷酸；转座酶；以及可转座元件，其中所述多核苷酸引导的效应蛋白和所述转座酶通过连接子部分在基因上融合或连接，使得所述转座酶被引导到所述靶多核苷酸内的所关注区域，并且将所述可转座元件插入到所述靶多核苷酸中，由此制备核酸构建体。6.根据权利要求5所述的方法，其中所述可转座元件包括经修饰的多核苷酸。7.根据权利要求4到6中任一项所述的方法，其中所述连接子部分是与所述多核苷酸引导的效应蛋白和所述转座酶结合的连接子多核苷酸。8.根据权利要求7所述的方法，其中所述连接子多核苷酸是tracrRNA、CRISPR RNA或单引导RNA。9.根据权利要求4到8中任一项所述的方法，其中连接子部分序列长度决定紧邻所述多核苷酸引导的效应蛋白接触的所述靶多核苷酸内的序列上游的原间隔子相邻基序(PAM)与所述转座酶将所述可转座元件插入到所述所关注区域的位点之间的序列长度。10.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述靶多核苷酸首先与所述多核苷酸引导的效应蛋白接触，并且然后与所述转座酶接触。11.根据权利要求1、2和10中任一项所述的方法，其中所述靶多核苷酸在不利于转座酶活性的条件下并且在所述转座酶与所述多核苷酸引导的效应蛋白结合之后与所述多核苷酸引导的效应蛋白、所述引导多核苷酸、所述转座酶和所述可转座元件接触，其中所述方法包括改变所述条件使得所述条件有利于转座酶活性。12.根据权利要求11所述的方法，其中在改变所述条件使得所述条件有利于转座酶活性之前，去除未与所述多核苷酸引导的效应蛋白结合的所述转座酶。
13.根据权利要求11或12所述的方法，其中所述不利于转座酶活性的条件包括不超过50mM或至少250mM的盐浓度和/或存在金属离子螯合剂。14.根据权利要求11到13中任一项所述的方法，其中所述有利于转座酶活性的条件包括超过50mM但小于250mM的盐浓度和/或不存在金属离子螯合剂和/或存在游离Mg2+离子。15.根据权利要求1到9中任一项所述的方法，其中使所述靶多核苷酸与包括所述多核苷酸引导的效应蛋白、所述引导多核苷酸、所述转座酶和所述可转座元件的复合物接触。16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述引导多核苷酸是引导RNA并且所述多核苷酸引导的效应蛋白是RNA引导的效应蛋白。17.根据权利要求17所述的方法，其中所述RNA引导的效应蛋白是RNA引导的核酸内切酶或RNA引导的核酸内切酶，其中所述RNA引导的核酸内切酶的核酸酶活性失效。18.根据权利要求18所述的方法，其中所述RNA引导的核酸内切酶的一个或多个催化性核酸酶位点失活。19.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸引导的效应蛋白是多种蛋白质组分的组装。20.根据权利要求19所述的方法，其中所述多核苷酸引导的效应蛋白是包括Cas6
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Cas7
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Cas8蛋白组装的级联。21.根据权利要求19所述的方法，其中所述多核苷酸引导的效应蛋白包括包含Cas、Cpf1或C2c2的一种或多种组分。22.根据权利要求19所述的方法，其中所述多核苷酸引导的效应蛋白是Cas12k。23.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述转座酶是多聚体蛋白。24.根据权利要求23所述的方法，其中所述多聚体蛋白包括玉米Ac转座子、果蝇P元件、Tn5、Tn7、Tn10、Mariner、IS10、IS50或MuA。25.根据权利要求1到4和6到24中任一项所述的方法，其中所述经修饰的多核苷酸包括点击反应性基团、荧光团、缀合剂、下拉基团、拴系部分、标志物、经修饰的碱基、脱碱基残基和/或间隔子。26.根据权利要求25所述的方法，其中所述标志物或下拉剂是生物素，和/或所述经修饰的多核苷酸包括碱基
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碱基缀合物和/或蛋白质
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碱基缀合物，和/或所述拴系部分是包括疏水区域、脂质、脂肪酸、甾醇、碳纳米管、多肽、蛋白质或氨基酸、胆固醇、棕榈酸酯或生育...

【专利技术属性】
技术研发人员：瑞贝卡，
申请(专利权)人：牛津纳米孔科技公开有限公司，
类型：发明
国别省市：