一种发根农杆菌介导的获得转基因除虫菊毛状根的方法技术

本发明专利技术公开了一种发根农杆菌介导的获得转基因除虫菊毛状根的方法，属于植物组织培养技术领域，其技术方案要点是，步骤如下：S1、切下除虫菊组培苗叶片，用菌液侵染叶片；S2、滤出叶片，接种于MS基本培养基中，暗培养2天；S3、将叶片移至固体培养基Ⅰ中培养20天，形成叶片根；S4、将叶片根的根尖切下，放置在固体培养基Ⅱ上，根尖朝上，培养7天，获毛状根；S5、选取不具向地性的毛状根，将毛状根的根尖切下放置在固体培养基Ⅲ上，培养20天，获抗性根；S6、选取抗性根，切成多段水平放置在固体培养基Ⅳ上，然后进行继代培养。本发明专利技术主要用于获得转基因除虫菊毛状根，建立了高效迅速的除虫菊毛状根转化体系，能够为除虫菊的科研及育种工作提供有效技术支撑。效技术支撑。效技术支撑。

【技术实现步骤摘要】
一种发根农杆菌介导的获得转基因除虫菊毛状根的方法


[0001]本专利技术涉及植物组织培养
，尤其涉及一种发根农杆菌介导的获得转基因除虫菊毛状根的方法。

技术介绍

[0002]除虫菊(Tanacetum cinerariifolium,syn.Chrysanthemum cinerariif olium)为菊科多年生宿根花卉，是提取天然杀虫剂除虫菊酯唯一集约化栽培的植物。因除虫菊酯对害虫杀灭活性强，对人体毒性低，在环境中容易降解为无毒物质，受到农业生产者的广泛认可。当前新兴的生物学技术为除虫菊的科研育种工作提供了新的方法。然而，因缺乏一个快速高效的本源转化体系，除虫菊的分子研究工作难以展开。
[0003]将外源基因导入细胞，然后诱导转基因细胞再生为植物是植物稳定转化的基本操作，该过程涉及细胞脱分化、T
‑
DNA整合、细胞再分化以及筛选转基因植物。因筛选和再生同时进行，这些过程漫长且繁琐，往往再生植物还未生长至足够大小，外植体就在抗生素的胁迫下死亡并释放的酚类物质毒害再生植物。目前，只有一项研究报道了除虫菊的转化，该方法利用根癌农杆菌转化除虫菊叶盘获得稳定的转基因植物。然而，因其实验周期长、转化效率低，这种方法不适用于除虫菊的分子研究。
[0004]迄今为止，关于除虫菊转基因的研究相对较少，目前已有的经典的转化方法耗时费力、效率低下。
[0005]为了解决上述问题，在现有技术的基础上提供了一种发根农杆菌介导的获得转基因除虫菊毛状根的方法。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是提供一种发根农杆菌介导的获得转基因除虫菊毛状根的方法，本专利技术取材容易、实验周期短、转基因材料扩增迅速、对除虫菊基因型的要求不高、成本低，且转化效率高，可快速在除虫菊中稳定表达外源基因；本专利技术首次建立了高效迅速的除虫菊毛状根转化体系，能够为除虫菊的科研及育种工作提供有效技术支撑。
[0007]本专利技术的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：
[0008]一种发根农杆菌介导的获得转基因除虫菊毛状根的方法，步骤如下：
[0009]S1、从除虫菊无性系W99组培苗的叶柄处切下叶片，并用OD
600
＝0.5的发根农杆菌MSU440菌液侵染所述叶片；
[0010]S2、将步骤S1所述的叶片滤出，并用滤纸吸干所述叶片表面的菌液，然后将所述叶片正面向上接种于MS基本培养基中，暗培养2天；
[0011]S3、将步骤S2所述的叶片转移至固体培养基Ⅰ中培养20天，诱导所述叶片形成叶片根；
[0012]S4、将所述叶片根的根尖切下，并将根尖并排水平放置在固体培养基Ⅱ上，然后将所述固体培养基Ⅱ直立放置，使根尖的尖端朝上放置，培养7天，获得毛状根；
[0013]S5、选取不具向地性的毛状根，将所述毛状根的根尖切下，然后并排水平放置在固体培养基Ⅲ上，培养20天，获得抗性根；
[0014]S6、选取能伸长的抗性根，将所述抗性根切成多段，并水平放置在固体培养基Ⅳ上，然后进行继代培养，即可获得转基因除虫菊毛状根。
[0015]进一步地，步骤S3中，所述固体培养基Ⅰ包括MS基本培养基和400mg/L头孢噻肟；步骤S4中，所述固体培养基Ⅱ包括MS基本培养基和400mg/L头孢噻肟。
[0016]进一步地，步骤S5中，所述固体培养基Ⅲ包括MS基本培养基、400mg/L头孢噻肟和10mg/L卡那霉素；步骤S6中，所述固体培养基Ⅳ包括MS基本培养基、400mg/L头孢噻肟和10mg/L卡那霉素。
[0017]进一步地，所述MS培养基、固体培养基Ⅰ、固体培养基Ⅱ、固体培养基Ⅲ和固体培养基Ⅳ均含有0.7％琼脂和3％蔗糖。
[0018]进一步地，所述MS培养基、固体培养基Ⅰ、固体培养基Ⅱ、固体培养基Ⅲ和固体培养基Ⅳ均置于温度为24
‑
26℃的黑暗条件下培养。
[0019]通过上述技术方案，发根农杆菌可以同时携带pRi和pTi质粒，可同时将两种质粒共同转入植物细胞，当细胞同时转入pRi和pTi质粒后可形成转基因毛状根；其中，pTi质粒携带目的基因，而pRi质粒是发根农杆菌自身携带的质粒，其具有合成生长素的相关基因，因此稳定转化pRi质粒的毛状根生长十分迅速；并且，pRi转化根对重力的敏感性低于正常根，其原因是携带的合成生长素的相关基因能干扰毛状根的向重力性；因此，利用重力及抗生素的双重筛选，可获得pRi和pTi质粒共转化的毛状根。
[0020]综上所述，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术取材容易、实验周期短、转基因材料扩增迅速、对除虫菊基因型的要求不高、成本低，且转化效率高，可快速在除虫菊中稳定表达外源基因；本专利技术首次建立了高效迅速的除虫菊毛状根转化体系，能够为除虫菊的科研及育种工作提供有效技术支撑。
附图说明
[0021]图1为本专利技术实施例1的遗传转化实验流程示意图；
[0022]图2为本专利技术实施例1的除虫菊毛状根诱导图，图中的标尺代表1.0cm；
[0023]图3为本专利技术实施例1的发根农杆菌(携带pBI121载体)介导的除虫菊转化，图中的标尺代表5.0mm；
[0024]图4为本专利技术实施例2的TcDXS过表达转基因发根的分子鉴定图，图中的标尺代表1.0cm；
[0025]图5为本专利技术实施例3的继代培养一个月后转基因毛状根的基因编辑情况分析图，图中的标尺代表1.0cm；
[0026]图6为本专利技术实施例3的利用GCMS测定TcEbF基因编辑发状根E
‑
(b)
‑
法尼烯含量变化图。
具体实施方式
[0027]下面结合附图和实施方式对本专利技术作进一步的详细说明：
[0028]实施例1：除虫菊毛状根标记基因GUS的转化，如图1所示，步骤如下：
[0029]S1、用YEP液体培养基培养含有pBI121载体的MSU440发根农杆菌至OD
600
为0.5，用含有100uM乙酰丁香酮的液体MS基本培养基重悬农杆菌，将OD600调至0.5。
[0030]在无菌的条件下，用手术刀将继代后生长近一个月的除虫菊无性系W99组培苗叶片从叶柄处切下，并用OD
600
＝0.5的发根农杆菌MSU440菌液侵染叶片；使发根农杆菌MSU440菌液漫过叶片，轻微晃动5min。
[0031]S2、将步骤S1的叶片滤出，并用滤纸吸干叶片表面的菌液，然后将叶片正面向上接种于MS基本培养基中，黑暗条件下共培养2天。
[0032]S3、将步骤S2的叶片转移至固体培养基Ⅰ中培养20天，诱导叶片形成叶片根，如图2a所示，图2a为转化20天后，叶片外植体出现根；固体培养基Ⅰ包括MS基本培养基和400mg/L头孢噻肟。
[0033]S4、用手术刀将叶片根的根尖切下，根尖长度约5mm，并将根尖并排水平放置在固体培养基Ⅱ上，然后将固体培养基Ⅱ直立放置，使根尖的尖端朝上放置，培养7天，获得毛状根，如图本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种发根农杆菌介导的获得转基因除虫菊毛状根的方法，其特征是，步骤如下：S1、从除虫菊无性系W99组培苗的叶柄处切下叶片，并用OD
600
＝0.5的发根农杆菌MSU440菌液侵染所述叶片；S2、将步骤S1所述的叶片滤出，并用滤纸吸干所述叶片表面的菌液，然后将所述叶片正面向上接种于MS基本培养基中，暗培养2天；S3、将步骤S2所述的叶片转移至固体培养基Ⅰ中培养20天，诱导所述叶片形成叶片根；S4、将所述叶片根的根尖切下，并将根尖并排水平放置在固体培养基Ⅱ上，然后将所述固体培养基Ⅱ直立放置，使根尖的尖端朝上放置，培养7天，获得毛状根；S5、选取不具向地性的毛状根，将所述毛状根的根尖切下，然后并排水平放置在固体培养基Ⅲ上，培养20天，获得抗性根；S6、选取能伸长的抗性根，将所述抗性根切成多段，并水平放置在固体培养基Ⅳ上，然后进行继代培养，即可获得转基因除虫菊毛状根。2.根据权利要求1所述的一种发根农杆菌介导的获得转基因除虫菊毛...

【专利技术属性】
技术研发人员：王彩云，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：