Spag6在制备缓解缺血性脑卒中再灌注介导的突触损伤药物中的应用制造技术

本发明专利技术提出了一种Spag6在缺血性脑卒中再灌注介导的突触损伤药物中的应用。本发明专利技术构建的Spag6慢病毒载体从动物水平验证明了Spag6能够促进突触蛋白的表达，减轻脑水肿。有望成为临床上治疗缺血性脑卒中再灌注介导的突触损伤药物。损伤药物。损伤药物。

【技术实现步骤摘要】
Spag6在制备缓解缺血性脑卒中再灌注介导的突触损伤药物中的应用


[0001]本专利技术属于药物新用途领域，具体涉及Spag6用于缓解缺血性脑卒中介导的突触损伤药物中的应用。

技术介绍

[0002]脑卒中(cerebral stroke)又称“中风”，是最常见的高死亡率和高致残率疾病。脑卒中包括缺血性卒中(Cerebral ischemic stroke，CIS)和出血性卒中(Cerebral hemorrhagic stroke，CHS)。现有资料显示，全球每年约有1500万人发生脑卒中，给家庭社会造成严重负担。目前，针对CIS治疗手段主要是在有效时间窗内实施溶栓治疗，尽快恢复血供以防止缺血区域扩散。一旦超过有效时间窗再溶栓治疗，将发生缺血性脑卒中再灌注(CerebralIschemic Stroke
‑
Reperfusion,CIS/R)损伤，其对脑神经的影响往往超过初期急性损伤，并可以继发局限性或广泛性脑水肿，使死亡率增加。现阶段的治疗方式都很难达到理想的效果，预后较差，较多患者难以恢复正常生活。
[0003]哺乳动物的精子相关抗原6(Sperm associated antigen 6，Spag6)在大脑、支气管等多个组织表达，是衣藻的PF16同源体，PF16在衣藻运动鞭毛的轴突中心管表达，并参与调节鞭毛运动。Spag6对运动纤毛的功能具有重要调控作用，Spag6缺失会导致小鼠精子鞭毛、支气管上皮细胞和脑室管膜细胞运动纤毛功能缺陷，表现为雄性不育、慢性呼吸道疾病等。近年来，有研究发现Spag6在神经系统中具有潜在的重要作用，已知Spag6缺失可致运动纤毛功能缺陷引发脑水肿。但在CIS/R继发脑水肿过程中，Spag6表达及其调控运动纤毛功能对脑损伤有什么作用，还无相关报道。

技术实现思路

[0004]本专利技术提出Spag6在缺血性脑卒中再灌注介导的突触损伤药物中的应用。解决现有技术中在进行缺铁性脑卒中再灌注治疗中出现的突触损伤问题。
[0005]本专利技术的技术方案是这样实现的：
[0006]Spag6在制备缓解缺血性脑卒中再灌注介导的突触损伤药物中的应用。
[0007]在一些实施例中，药物活性成分为含有Spag6编码基因的慢病毒或腺病毒载体。
[0008]在一些实施例中，慢病毒载体采用CV186质粒，且具有Ubi
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MCS
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3FLAG
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SV40
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Cherry
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IRES
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puromycin基因结构。
[0009]在一些实施例中，药物为无菌注射溶液形式的剂型。
[0010]在一些实施例中，本专利技术提供一种制备表达Spag6的慢病毒载体的方法，步骤如下：
[0011](1)将Spag6基因插入到CV186质粒上，构建Spag6过表达质粒：提取Hela细胞RNA，逆转录得cDNA，设计Spag6引物：
[0012]Spag6l(59908
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1)
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p1：AGGTCGACTCTAGAGGATCCCGCCACCATGAGCCAGCGGCAGGTGCTTC，
[0013]Spag6l(59908
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1)
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p2：TCCTTGTAGTCCATACCGGTCTGTGGCTGGTAGCTGTCCACCC，
[0014]PCR克隆目的基因Spag6，并进行电泳、割胶纯化，用BamHI/AgeI对克隆的目的基因Spag6进行双酶切得到目的基因片段，质粒载体CV186双酶切后回收线性化的载体片段，目的基因片段与线性化的载体片段连接后转化E.coli感受态细胞，用菌落PCR鉴定转化子，阳性克隆送测序，测序无误的克隆进行质粒抽提，命名为KL59908
‑
1；
[0015](2)将Spag6基因整合到慢病毒载体上，构建Spag6过表达慢病毒
[0016]Spag6过表达载体构建：用抽提得到的KL59908
‑
1质粒，转化E.coli感受态细胞，进行大量克隆，并抽提KL59908
‑
1质粒，用于慢病毒包装；
[0017]慢病毒包装：将携带Spag6的载体质粒KL59908
‑
1与慢病毒包装质粒pHelper1.0以及pHelper2.0共转染293T细胞，以质量比3:2:1混合，在细胞内发生同源重组，形成携带Spag6基因的重组慢病毒，命名为LV
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Spag6l(59908
‑
1)，经扩增、纯化、滴度测定获得2
×
108IU/ml高滴度的Spag6过表达慢病毒。
[0018]构建慢病毒并感染至大鼠脑组织，用于调控神经细胞中Spag6的表达。
[0019]慢病毒(Lentivirus)载体是以人类克疫缺陷型病毒(HIV)为基础发展起来的基因治疗载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力，可以在体内较长期的表达且安全性高。本研究构建的的慢病毒为“自杀”性病毒，即病毒感染目的细胞后不会再感染其他细胞，也不会利用宿主细胞产生新的病毒颗粒。慢病毒中的毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所替代，属于假型病毒。
[0020]构建Spag6过表达慢病毒：
[0021]利用限制性内切酶消化获得线性化载体。PCR扩增制备目的基因片段。所用扩增引物在设计时需在其5
’
端添加同源重组序列，使用该引物扩增目的基因片段，扩增产物5
’
和3
’
最末端的序列分别不线性化克隆载体两末端序列完全一致。以线性化载体和目的基因扩增产物配制反应体系，进行重组反应，实现线性化载体和目的基因片段的体外环化。重组产物直接进行转化，挑取平板上的单克隆进行PCR鉴定，对阳性克隆进行测序及结果分析。将正确克隆菌液扩大培养、抽提，获得高纯度质粒。
[0022]将携带Spag6的载体质粒与慢病毒包装质粒pHelper1.0以及pHelper2.0共转染293T细胞，以质量比3:2:1混合，在细胞内发生同源重组，形成携带Spag6基因的重组慢病毒，命名为LV
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Spag6l(59908
‑
1)，经扩增、纯化、滴度测定获得2
×
108IU/ml高滴度的Spag6过表达慢病毒。
[0023]本专利技术相比于现有技术具有以下有益效果：
[0024]Spag6能够改善缺血性脑卒中在灌注介导的突触损伤。有望成为临床上用于治疗和改善缺血性脑卒中灌注治疗后引起的突触损伤。
附图说明
[0025]为了更清楚地说明本专利技术实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本专利技术的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.Spag6在制备缓解缺血性脑卒中再灌注介导的突触损伤药物中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的药物的活性成分为含有Spag6编码基因的慢病毒或腺病毒载体。3.根据权利要求2所述的慢病毒载体，其特征在于：所述慢病毒载体采用CV186质粒，且具有Ubi
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MCS
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3FLAG
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SV40
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Cherry
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IRES
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puromycin基因结构。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述药物为无菌注射溶液形式的剂型。5.一种制备表达Spag6的慢病毒载体的方法，步骤如下：(1)将Spag6基因插入到CV186质粒上，构建Spag6过表达质粒：提取Hela细胞RNA，逆转录得cDNA，设计Spag6引物：Spag6l(59908
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1)
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p1：AGGTCGACTCTAGAGGATCCCGCCACCATGAGCCAGCGGCAGGTGCTTC，Spag6l(59908
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1)
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p2：TCCTTGTAGTCCATACCGGTCTGTGGCT...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹晓璐，胡一鸣，张玲，柳赟昊，石玉琴，付国庆，周婷，全超，
申请(专利权)人：武汉科技大学，
类型：发明
国别省市：