单个球虫卵囊的分离方法和应用技术

本发明专利技术提供一种单个球虫卵囊的分离方法和应用，涉及球虫卵囊分离技术领域。本发明专利技术的分离方法，在透明的容器底部进行标记和定位，再取卵囊液滴加至凝胶上，通过显微镜观察凝胶表面上的滴液中是否含有单个卵囊，并对含有单个卵囊的位置进行记录，用吸管挖取空白凝胶作为封顶，再挖取含有单个卵囊滴液的凝胶作为垫底，如此可简便地将单个卵囊固定于凝胶块内。本发明专利技术的分离方法简单易操作，可缩短分离时间，提高分离效率。提高分离效率。提高分离效率。

【技术实现步骤摘要】
单个球虫卵囊的分离方法和应用


[0001]本专利技术涉及球虫卵囊分离
，具体涉及一种单个球虫卵囊的分离方法和应用。

技术介绍

[0002]鸡球虫的感染具有自限性，一段时间内会在宿主体内排空，且宿主特异性很高；鸡球虫采用口服的方式接种，接种方式简单，容易实施。基于上述优点，鸡球虫是一种优秀的疫苗载体。通过基因编辑技术，将抗原基因敲入到鸡球虫的基因组中，使其表达组成性抗原蛋白，从而使机体获得对抗该抗原的免疫力。此过程中，通常需要加入荧光标签蛋白对基因编辑阳性虫株进行筛选，因此，通过分离单个表达荧光标签的球虫使其扩繁成为单纯的基因编辑阳性株是必不可少的步骤。
[0003]现有技术中主要通过以下方法分离鸡球虫单个卵囊：将玻璃纸切成长宽均为0.5cm的小块，再将稀释到一定浓度的卵囊液滴至玻璃纸块上，再用光学显微镜进行观察。但是该方法存在以下缺陷：1、材料准备过程漫长且操作复杂，将玻璃纸切割成为长宽为0.5cm的小块需要花费较多的时间，期间还需要保证易碎的玻璃纸不破碎且不飞走，需要花费大量时间；将球虫卵囊液滴加在玻璃纸上，玻璃纸容易发生意外挪动，造成选好的单卵囊玻璃纸颠覆，使卵囊液粘在置物台或者几片纸重叠粘连等情况，只能重新选取，极其浪费时间。2、由于纸片不易固定和保存，移动距离不能过远，必须在分离单卵囊的场所接种动物，容易造成动物被其他卵囊污染，也限制了动物接种地点和单卵囊的分离实验室的距离。3、将卵囊滴加在纸片上面，液体蒸发速度快，卵囊很快处于干燥的不利环境，使得卵囊活性下降。

技术实现思路

[0004]基于此，有必要针对上述问题，提供一种球虫卵囊的分离方法，该方法简单易操作，而且避免传统玻璃纸片法中的纸片粘连、颠覆、干燥等问题，缩短分离时间，提高分离效率，降低分离成本。
[0005]一种单个球虫卵囊的分离方法，包括以下步骤：
[0006]标记：取透明的容器，在容器的底部做若干个固定的标记，并区分各个标记的位置，所述若干个标记之间相互分离；
[0007]制备平板：将灭菌的凝胶液倒入做好标记的容器中，待凝胶液凝固，得到凝胶平板；制备空白凝胶平板备用；
[0008]滴加：将孢子化的球虫卵囊用水稀释制成卵囊液，混合均匀后吸取卵囊液滴加至凝胶平板上，每次滴加的位置对应一个标记；
[0009]记录：在显微镜下观察凝胶平板表面滴液中是否含有单个球虫卵囊，记录单个球虫卵囊滴液所在位置对应的容器上的标记；
[0010]分离：用吸管在空白凝胶平板上挖取空白凝胶作为封顶凝胶，用该吸管继续在已
确定有单个球虫卵囊的凝胶平板上挖取表面具有单个球虫卵囊的凝胶作为垫底凝胶，将单个球虫卵囊固定于封顶凝胶和垫底凝胶之间，即分离出单个球虫卵囊。
[0011]上述分离方法中，通过标记将凝胶平板划分为若干区域，将卵囊液滴加在凝胶上，通过显微镜观察并记录滴液中含有单个球虫卵囊所在的位置，并巧妙利用吸管挖取含有单个球虫卵囊的凝胶，操作过程中可有效避免玻璃纸方法中玻璃纸移位、颠覆、粘连，卵囊粘附在毛细吸管上等问题，且卵囊处于凝胶的夹层中，凝胶能提供相对纸片更高的湿度，有利于卵囊保持活性。本专利技术的分离方法准备材料简单、操作简单，分离高效，可避免其他微生物污染，对分离场所和接种地点距离无限制，而且分离的球虫卵囊方便储存和运输。
[0012]在其中一个实施例中，所述标记步骤中，透明的容器为玻璃培养皿，每个标记的形状和大小相同，相邻两个标记之间的间隔为3
‑
5mm。
[0013]在其中一个实施例中，所述制备平板步骤中，所述凝胶液为琼脂糖凝胶液，所述琼脂糖凝胶液中琼脂糖的浓度为0.01
‑
0.02g/mL。
[0014]在其中一个实施例中，所述制备平板步骤中，凝胶的厚度为2
‑
3mm。
[0015]在其中一个实施例中，所述滴加步骤中，所述卵囊液的浓度为200
‑
1000个/mL，吸取的卵囊液的体积为1.5
‑
2.5μL。优选地，卵囊液的浓度为500个/mL，每次吸取的卵囊液的体积为2μL，即每次吸取的卵囊液中含有约1个卵囊。
[0016]在其中一个实施例中，所述滴加步骤中，所述球虫卵囊为柔嫩艾美尔球虫卵囊。
[0017]在其中一个实施例中，所述分离步骤中，吸管的直径为5
‑
7mm。
[0018]在其中一个实施例中，所述分离步骤后还包括后处理：用工具将吸管内的凝胶推至吸管内部，并将吸管两端封口。封口后将凝胶和球虫卵囊封闭在吸管内，方便储存和运输，同时也可避免被其他微生物污染。
[0019]在其中一个实施例中，吸管两端的封口与凝胶的距离为4
‑
5cm；所述工具为消毒的解剖针，吸管为塑料吸管，封口采用热封。
[0020]本专利技术还提供一种球虫卵囊的接种方法，取上述分离方法得到的单个球虫卵囊，连带凝胶一同推入待接种的动物口中，喂水使其吞下。
[0021]与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
[0022]本专利技术的分离方法，通过标记将凝胶平板划分为若干区域，将卵囊液滴加在凝胶上，通过显微镜观察并记录滴液中含有单个球虫卵囊所在的位置，并巧妙利用吸管挖取含有单个球虫卵囊的凝胶，操作过程中可有效避免玻璃纸方法中玻璃纸移位、颠覆、粘连，卵囊粘附在毛细吸管上等问题，且卵囊处于凝胶的夹层中，凝胶能提供相对纸片更高的湿度，有利于卵囊保持活性。本专利技术的分离方法准备材料简单、操作简单，分离高效，可避免其他微生物污染，对分离场所和接种地点距离无限制，而且分离的球虫卵囊方便储存和运输。
附图说明
[0023]图1为实施例中培养皿底部标记示意图。
具体实施方式
[0024]为了便于理解本专利技术，以下将给出较佳实施例对本专利技术进行更全面的描述。但是，本专利技术可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实
施例的目的是使对本专利技术的公开内容的理解更加透彻全面。
[0025]除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本专利技术的
的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本专利技术的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本专利技术。
[0026]实施例1
[0027]一、准备检测装置和材料
[0028]检测装置：荧光倒置显微镜。
[0029]材料：细菌培养皿，250mL锥形瓶，琼脂糖凝胶粉，纯水，塑料吸管，解剖针，手术剪，无齿镊，10μL移液枪头，10μL移液枪，酒精灯，白纸。
[0030]琼脂糖凝胶液：取1.5g琼脂糖凝胶粉末加入250mL锥形瓶，加入100mL纯水，高压灭菌，备用。
[0031]二、分离
[0032]1、在白纸上打印如图1所示的标记，外圆圈直径为90mm，内部共45个小圆圈，根据坐标系可以对每个小圆圈的位置进行准确标记，每个小圆圈的直径约为3mm，各标记均匀间隔分布。取尺寸匹配的细本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种单个球虫卵囊的分离方法，其特征在于，包括以下步骤：标记：取透明的容器，在容器的底部做若干个固定的标记，并区分各个标记的位置，所述若干个标记之间相互分离；制备平板：将灭菌的凝胶液倒入做好标记的容器中，待凝胶液凝固，得到凝胶平板；制备空白凝胶平板备用；滴加：将孢子化的球虫卵囊用水稀释制成卵囊液，混合均匀后吸取卵囊液滴加至凝胶平板上，每次滴加的位置对应一个标记；记录：在显微镜下观察凝胶平板表面滴液中是否含有单个球虫卵囊，记录单个球虫卵囊滴液所在位置对应的容器上的标记；分离：用吸管在空白凝胶平板上挖取空白凝胶作为封顶凝胶，用该吸管继续在已确定有单个球虫卵囊的凝胶平板上挖取表面具有单个球虫卵囊的凝胶作为垫底凝胶，将单个球虫卵囊固定于封顶凝胶和垫底凝胶之间，即分离出单个球虫卵囊。2.根据权利要求1所述的单个球虫卵囊的分离方法，其特征在于，所述标记步骤中，透明的容器为玻璃培养皿，每个标记的形状和大小相同，相邻两个标记之间的间隔为3
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5mm。3.根据权利要求1所述的单个球虫卵囊的分离方法，其特征在于，所述制备平板步骤中，所述凝胶液为琼脂糖凝胶液，所述琼脂糖凝胶液中琼脂糖的浓度为0.01
‑
0.02g/mL。4.根据权利要求1所述的单个球...

【专利技术属性】
技术研发人员：林瑞庆，陆肖，蔡晓懿，周德荣，孟甜，方园婷，王瑞珍，翁亚彪，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：