海水寄生纤毛虫刺激隐核虫的外泌体提取分离方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种海水寄生纤毛虫刺激隐核虫的外泌体提取分离方法，其包括以下步骤：一、收集刺激隐核虫包囊后，将包囊清洗干净，置于含有抗生素的无菌海水中进行孵化；二、使用无菌滤网收集感染期幼虫，在含有抗生素、无外泌体胎牛血清的培养基中，孵育培养；三、离心去除感染期幼体，收集上清液；四、上清液通过滤膜除菌，浓缩滤液；五、浓缩液离心收集外泌体粗沉淀；六、外泌体粗沉淀使用无菌预冷的PBS重悬，并加入蛋白酶抑制剂；七、离心去除上清液，使用重悬沉淀，获得所述外泌体。本发明专利技术能够有效分离提取刺激隐核虫的外泌体，提取后的外泌体具有典型的碟形或茶托形囊泡状结构，粒径大小整体符合标准，且外泌体提取浓度较高。且外泌体提取浓度较高。且外泌体提取浓度较高。

【技术实现步骤摘要】
海水寄生纤毛虫刺激隐核虫的外泌体提取分离方法及应用


[0001]本专利技术属于外泌体提取领域。更具体地说，本专利技术涉及一种海水寄生纤毛虫刺激隐核虫的外泌体的提取分离方法。

技术介绍

[0002]刺激隐核虫(Cryptocaryon irritans Brown1951)，俗称海水小瓜虫，属于前口纲(Class Prostomatea)、前管目(Order Proreodonisa)、隐核虫科(Family Cryptocaryonidae)、隐核虫属(Genus Cryptocaryon)。刺激隐核虫作为一种寄生性海水纤毛虫，广泛分布于大西洋、加勒比海、波斯湾、印度洋、我国东海和南海等热带和亚热带海域，对少数软骨鱼和绝大多数硬骨鱼类都具有很强的感染性。刺激隐核虫主要寄生宿主的背部皮肤，鳍条和鳃瓣，以及眼角膜和口腔等暴露位置。受感染的患鱼皮肤和鳃因受到刺激，从而分泌大量粘液，甚至形成增生组织。严重感染病鱼体表形成一层浑浊的白色粘膜，皮肤出现密集的点状充血，眼角膜出现损伤。严重的机械损伤往往又导致继发性细菌感染，引起体表溃烂，喙部、鳍条溃烂缺损，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种海水寄生纤毛虫刺激隐核虫的外泌体提取分离方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、收集刺激隐核虫包囊后，将包囊清洗干净，置于含有抗生素的无菌海水中进行孵化；步骤二、包囊孵化，感染期幼虫逸出后，使用无菌滤网收集感染期幼虫，在含有抗生素、无外泌体胎牛血清的海水等渗Leibovitz's L
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15细胞培养基中，孵育培养；步骤三、离心去除感染期幼体，收集上清液；步骤四、上清液滤膜除菌，浓缩滤液，获得浓缩液；步骤五、浓缩液离心收集外泌体粗沉淀；步骤六、外泌体粗沉淀使用无菌预冷的PBS重悬，并加入1
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HALT蛋白酶抑制剂；步骤七、离心去除上清液，使用预冷DEPC PBS溶液重悬沉淀，获得所述刺激隐核虫外泌体。2.根据权利要求1所述的海水寄生纤毛虫刺激隐核虫的外泌体提取分离方法，其特征在于，步骤一中，所述抗生素为80
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100I.U.ml
–1青霉素、80
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100μg ml
–1硫酸链霉素。3.根据权利要求1所述的海水寄生纤毛虫刺激隐核虫的外泌体提取分离方法，其特征在于，步骤二中，无菌滤网收集感染期幼虫后稀释至1
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106id/ml浓度培育，无外泌体胎牛血清在培养基中的质量分数为10
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15％，孵育培养温度为25℃，孵育培养时间≥4h。4...

【专利技术属性】
技术研发人员：乔莹，马笑晚，陈旭阳，陈佳，潘莹，
申请(专利权)人：自然资源部第四海洋研究所中国—东盟国家海洋科技联合研发中心，
类型：发明
国别省市：