本发明专利技术属于球虫耐药株诱导及获取技术领域，具体涉及一种与抗球虫药相关的模拟田间快速诱导耐药株试验及耐药株的分离鉴定方案。本发明专利技术所述模拟田间快速诱导抗球虫药耐药株的方法，通过设计前后两批快速诱导耐药株试验，能够在7周之内快速筛选出多株稳定的耐药虫株，进而在较短的时间内获得足够数量的耐药虫株。该试验在保证原始虫株背景清晰的情况下，能够快速筛选球虫耐药株，具有较高的时效性，满足后续深入分析所需要的样品数量，并且该方案在前后两种药物耐药株筛选的试验上均验证了该方法的可靠性，具有耗时短、操作简单，成本低的优势，可广泛应用于鸡球虫耐药株的试验诱导、筛选及鉴定。筛选及鉴定。筛选及鉴定。
【技术实现步骤摘要】
一种模拟田间快速诱导抗球虫药耐药株的方法及其分离鉴定方法
[0001]本专利技术属于球虫耐药株诱导及获取
，具体涉及一种与抗球虫药相关的模拟田间快速诱导耐药株试验及耐药株的分离鉴定方案。
技术介绍
[0002]鸡球虫病是由艾美耳属球虫引起的一种常见的寄生虫病，该病危害极为严重，每年全球因球虫病的感染造成大约30亿美元的损失，是鸡病中引起经济损失最为严重的疾病之一。艾美耳属(Eimeria)球虫隶属顶复门，目前已报道1800余种，现已发现并公认能够引起感染的艾美耳球虫有7种，即柔嫩艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫、和缓艾美耳球虫、早熟艾美耳球虫和布氏艾美耳球虫。球虫能够破坏鸡肠上皮细胞，在规模化养殖中，以死亡率高为特征的球虫病爆发不常见，临床多见鸡食欲不振、精神萎靡、生产性能下降等症状，感染时常表现两种或两种以上的混合感染。
[0003]现阶段，养殖业对鸡球虫病的防控多以药物防控为主、疫苗使用为辅。但是，随着药物的广泛使用，诸多耐药株相继报道。目前，球虫领域对耐药性问题的解析，多集中在研究各地区耐药株的流行情况以及利用比较转录组学研究敏感株与耐药株基因表达水平的差异，尚无分子机制层面的解析。
[0004]重测序技术为我们解析找到药物靶点提供了技术平台，但其前提则是获得足够数量的耐药株样本。目前，获得耐药株的策略主要包括实验室药物梯度诱导以及田间耐药株筛选，前者虽能够获得中间代次的样品，追溯实验进化的动态过程，但其耗时较长，过程繁琐且获得的样本数量较少；而后者虽然能够获得不同的样本，但筛选到样品则会因为区域差异、背景复杂等因素影响后续的分析。另外，针对一些抗球虫药产生耐药性突变频率低，耐药株不易获取等问题，亟待建立一种高效的耐药株诱导试验方案，以便解析相关抗性机制，指导后续养殖业用药。
技术实现思路
[0005]为此，本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种模拟田间快速诱导抗球虫药耐药株的方法，以解决现有技术中筛选的耐药株试验方案存在耗时长、地方株背景复杂等问题，以便快速有效地筛选到足够数量的背景清晰、抗性稳定的耐药虫株；
[0006]本专利技术所要解决的第二个技术问题在于提供一种抗球虫药耐药株的分离鉴定方法。
[0007]为解决上述技术问题，本专利技术所述的一种模拟田间快速诱导抗球虫药耐药株的方法，包括如下步骤：
[0008](1)在垫料上散养雏鸡，设置加药组和球虫接种组，所述接种组的雏鸡接种孢子化的艾美耳球虫卵囊，且试验期间不添加任何抗球虫药物的饲料，所述加药组的雏鸡饲喂的饲料中添加含有工作浓度的抗球虫药物；
[0009](2)在所述接种组的雏鸡接种的球虫完成一个生活周期后，收集所述接种组垫料中的新鲜粪便，并抛洒至所述加药组雏鸡的垫料表面以保证所述加药组的雏鸡能够感染，此后每隔七天向所述加药组投放所述接种组的垫料上的新鲜粪便；
[0010](3)在试验周期内，每天分别收集所述接种组以及加药组雏鸡的新鲜粪便进行卵囊计数，并绘制排卵囊曲线，观察所述加药组雏鸡出现排卵囊的高峰时间；能够发现加药组在5周左右出现排卵囊高峰；
[0011](4)第一试验周期结束后，另外选取新的雏鸡进行二次试验，其中，第一试验组的雏鸡饲养在原加药组垫料上，第二试验组的雏鸡则饲养在无球虫的新鲜垫料上；两组雏鸡均用含有不低于工作浓度的抗球虫药物拌料饲喂，并定期采集第一试验组垫料中的新鲜粪便，抛洒在第二试验组的垫料表面，进行感染；
[0012](5)分别定期采集所述第一试验组和第二试验组雏鸡盲肠，以每只雏鸡的盲肠内容物作为一个耐药株样品，观察盲肠病变情况，并单独收集每只雏鸡的盲肠卵囊，计数并进行孢子化处理；
[0013](6)利用高剂量抗球虫药物进行拌料喂饲无球虫雏鸡，并对雏鸡经口接种之前收集盲肠内容物后孢子化卵囊，收取接种后6
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10天粪便中的卵囊，即得所需耐药株。
[0014]具体的，所述步骤(1)和步骤(4)中，所述抗球虫药物包括盐霉素，其工作浓度为60mg/kg。
[0015]具体的，所述步骤(2)中，向所述加药组投放所述接种组的垫料中产生的新鲜粪便的步骤中，定期投放的周期为选定球虫株的排卵高峰期。
[0016]具体的，所述步骤(4)和(5)中，所述定期采集步骤的间隔周期为选定球虫株的排卵高峰期。
[0017]在本专利技术方案中，抛洒粪便的时间点和收集卵囊的时间点为不同种球虫的排卵囊高峰期，具体间隔时间的选定需根据试验针对的球虫种排卵囊高峰期。
[0018]具体的，所述步骤(6)中，所述高剂量抗球虫药物的浓度为其工作浓度的3
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4倍剂量，并不超过选定药物的中毒剂量，即需根据该药物的中毒剂量选择最大的药物使用浓度。
[0019]本专利技术公开了一种抗球虫药耐药株的分离鉴定方法，包括如下步骤：
[0020](a)将在高剂量药物浓度筛选下分离获得的卵囊，在不低于工作浓度的抗球虫药物下进行扩繁；
[0021](b)收集扩繁后的卵囊进行孢子化处理，并进行纯化处理；
[0022](c)对纯化后的所述卵囊进行DNA模板提取；
[0023](d)以提取得到的基因组DNA为模板，以适宜于检测艾美耳球虫的特异引物进行PCR扩增；
[0024](e)PCR产物经凝胶电泳检测后，回收并连接T载体，随后转化感受态细胞进行培养，挑取单克隆进行PCR鉴定，并选取阳性克隆测序。
[0025]具体的，所述步骤(d)中，所述适宜于检测艾美耳球虫的特异引物设计参照文献Haug A,Thebo P,Mattsson J G.A simplified protocol for molecular identification of Eimeria species in field samples.Veterinary Parasitology,2007,146(1
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2):35～45.，具体包括：
[0026]适宜于检测堆型艾美耳球虫的Ac引物对，具体包括：
[0027]Ac
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F：GGGCTTGGATGATGTTTGCTG；
[0028]Ac
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R：GCAATGATGCTTGCACAGTCAGG；
[0029]适宜于检测柔嫩艾美耳球虫的Tn引物对，具体包括：
[0030]Tn
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F：AATTTAGTCCATCGCAACCCTTG；
[0031]Tn
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R：CGAGCGCTCTGCATACGACA；
[0032]适宜于检测巨型艾美耳球虫的Mx引物对，具体包括：
[0033]Mx
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F：GTGGGACTGTGGTGATGGGG；
[0034]Mx
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R：ACCAGCATGCGCTCACAACCC；
[0035]适宜于检测和缓艾美耳球虫的Mt引物对，具体包括：
[0036]Mt<本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种模拟田间快速诱导抗球虫药耐药株的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)在垫料上散养雏鸡，设置加药组和球虫接种组，所述接种组的雏鸡接种孢子化的艾美耳球虫卵囊，且试验期间不添加任何抗球虫药物的饲料，所述加药组的雏鸡饲喂的饲料中添加含有工作浓度的抗球虫药物；(2)在所述接种组的雏鸡接种的球虫完成一个生活周期后，收集所述接种组垫料中的新鲜粪便，并抛洒至所述加药组雏鸡的垫料表面以保证所述加药组的雏鸡能够感染，此后定期向所述加药组投放所述接种组的垫料上的新鲜粪便；(3)在试验周期内，每天分别收集所述接种组及加药组雏鸡的新鲜粪便进行卵囊计数，并绘制排卵囊曲线，观察所述加药组雏鸡出现排卵囊的高峰时间；(4)第一试验周期结束后，另外选取新的雏鸡进行二次试验，其中，第一试验组的雏鸡饲养在原加药组垫料上，第二试验组的雏鸡则饲养在无球虫的新鲜垫料上；两组雏鸡均用含有不低于工作浓度的抗球虫药物拌料饲喂，并定期采集第一试验组垫料中的新鲜粪便，抛洒在第二试验组的垫料表面，进行感染；(5)分别定期采集所述第一试验组和第二试验组雏鸡盲肠，以每只雏鸡的盲肠内容物作为一个耐药株样品，观察盲肠病变情况，并单独收集每只雏鸡的盲肠卵囊，计数并进行孢子化处理；(6)利用高剂量抗球虫药物进行拌料喂饲无球虫雏鸡，并对雏鸡经口接种之前收集盲肠内容物后孢子化卵囊，收取接种后6
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10天粪便中的卵囊，即得所需耐药株。2.根据权利要求1所述模拟田间快速诱导抗球虫药耐药株的方法，其特征在于，所述步骤(2)和步骤(3)中，收集所述新鲜粪便的步骤采用“五点取样法”进行。3.根据权利要求1或2所述模拟田间快速诱导抗球虫药耐药株的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，向所述加药组投放所述接种组的垫料中产生的新鲜粪便的步骤中，定期投放的周期为选定球虫株的排卵高峰期。4.根据权利要求1
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3任一项所述模拟田间快速诱导抗球虫药耐药株的方法，其特征在于，所述步骤(4)和(5)中，所述定期采集步骤的间隔周期为选定球虫株的排卵高峰期。5.根据权利要求1
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4任一项所述模拟田间快速诱导抗球虫药耐药株的方法，其特征在于，所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘贤勇，索勋，孙霈，郝振凯，毕菲菲，胡丹丹，于咏兰，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：
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