一种肾形虫种株长期保种及快速复苏的方法技术

本发明专利技术属于功能物种种质资源长期保藏领域，具体涉及一种肾形虫虫株长期保种及快速复苏的方法，该方法选取0.22μm微孔滤膜作为保种介质。这种保种方法可短时间内使虫体进入包囊并附着于滤膜上，可长期稳定的对肾形虫种株进行保种，与传统的保种方法相比此法更为便捷，还具有更长的保存时间、相对容易达到的保种条件、更低廉的成本、方便运输和携带等优势。本发明专利技术也涉及从微孔滤膜复苏得到大密度的肾形虫，复苏过程简单，不受温度和时间的限制，效果显著。本发明专利技术的肾形虫种株稳定保种有效期可达半年以上，有效的解决了繁琐的保种程序、空间的限制和运输过程中虫体死亡等问题。间的限制和运输过程中虫体死亡等问题。间的限制和运输过程中虫体死亡等问题。

【技术实现步骤摘要】
一种肾形虫种株长期保种及快速复苏的方法


[0001]本专利技术属于功能物种种质资源长期保藏领域，具体涉及一种肾形虫种株长期保种及快速复苏的方法利，用0.22μm微孔滤膜对肾形虫种株进行长期保存和保种后利用蒸馏水和灭菌麦粒对样品进行复苏的方法。

技术介绍

[0002]现有技术报道的自由生纤毛虫的保种方法中的物种、保种方法、保种目的及效果如下表：
[0003][0004]现有的保种方法存在的主要缺陷包括：
[0005](1)尚未建立一种针对肾形虫的长期保种和高效复苏方法。
[0006](2)以往采用自由生纤毛虫通用的保种方式，对仪器和条件要求较高，稳定性差，保种时间短，需要定期维护和反复复苏以保持活性；
[0007](3)以往的保种方式对运输条件要求高，不耐受长距离和高温及低温环境。
[0008]原生动物的物种保存工作至关重要，是所有以原生动物为实验材料的科研工作的重要前提，目前已有的纤毛虫通用保种方法对肾形虫种株的保种效果并不理想，如何便捷高效的对肾形虫种株进行长期保存和迅速复苏为本专利技术需要解决的问题。

技术实现思路

[0009]鉴于现有技术存在的问题，本专利技术提供了利用0.22μm微孔滤膜对肾形虫种株进行长期保存和保种后利用蒸馏水和灭菌麦粒对样品进行复苏的方法。
[0010]本专利技术通过以下技术方案来实现：
[0011]一种肾形虫虫株长期保种方法，其他在于，包括：
[0012](1)肾形虫的培养，挑取单个细胞进行单克隆培养，培养至对数生长期进行保种；
[0013](2)选取0.22μm微孔滤膜作为保种介质；
[0014](3)将0.22μm微孔滤膜置于过滤器上，将一定体积的虫液缓缓倾倒在过滤器上，待过滤完成后，取下滤膜，待干后，置于容器中保存。
[0015]作为本专利技术的一种优选技术方案，步骤(1)包括：可于有机质含量丰富的土壤中采集土样，利用“非淹没培养法”孵化土壤中的肾形虫，96小时后在体式显微镜下利用微吸管挑取肾形虫单个细胞。
[0016]作为本专利技术的一种优选技术方案，步骤(1)包括：挑取单个细胞后，在24孔板中每孔添加1ml蒸馏水和一颗麦粒，于20～25℃的恒温恒湿培养箱中建立单克隆培养系，72小时后将24孔板各孔的同种肾形虫混合转移至六孔板，每孔倒入10ml蒸馏水并加两颗灭菌后的麦粒，20～25℃的恒温恒湿培养箱中进行大量纯培养72小时，取对数生长期的虫体培养液进行保种。
[0017]作为本专利技术的一种优选技术方案，步骤(2)包括：将0.22μm微孔滤膜进行裁剪至和过滤装置的型号匹配的尺寸，后将0.22μm滤膜置于超净工作台中进行紫外灭菌20min后再进行保种。
[0018]作为本专利技术的一种优选技术方案，步骤(3)包括：取下滤膜，室温条件自然风干后，将滤膜折叠好置于离心管中，室温条件保存。
[0019]作为本专利技术的一种优选技术方案，步骤(3)包括：将0.22μm微孔滤膜置于过滤器上，将体积为10ml的虫液缓缓倾倒在过滤器上，待过滤完成后，用镊子取下微孔滤膜，室温条件下自然风干1小时，将风干后的滤膜折叠好置于15ml离心管中，室温条件保存。
[0020]本专利技术进一步提供了一种肾形虫虫株快速复苏方法，将前述方法保护的肾形虫虫株，进一步通过步骤(4)复苏，步骤(4)包括：在肾形虫种株复苏时，吸取10ml蒸馏水于六孔板中并加入2颗灭菌后的麦粒，将附着虫体的微孔滤膜置于六孔板中，20
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25℃恒温恒湿培养箱中培养96小时，镜检观察。
[0021]作为本专利技术的一种优选技术方案，吸取10ml蒸馏水于六孔板中并加入2颗灭菌后的麦粒，将附着虫体的微孔滤膜置于六孔板中，20
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25℃恒温恒湿培养箱中培养24小时，镜检观察虫体生长状态，继续培养至72小时肾形虫达到最大种群密度。
[0022]作为本专利技术的一种优选技术方案，滤膜为0.22μm的混合纤维素(MCE)微孔滤膜。
[0023]通过大量的试验研究发现：利用规格为0.22μm的混合纤维素(MCE)微孔滤膜保种14天、28天和170天三个时间点样品的复苏生长曲线都在72小时群密度达到最大，微孔滤膜保种效果受保种时间长度和保种温度的影响不显著，微孔滤膜可对肾形虫种株在室温条件下进行长期稳定的保种。
[0024]本专利技术相对于现有技术的有益效果包括：
[0025]1)建立了一种适用于肾形虫种株的保种及复苏方法，有效解决了常规的4℃恒温恒湿培养箱肾形虫保种难度大、复苏时间长及远距运输不便等问题；
[0026]2)该方法包括利用微孔滤膜作为保种介质对肾形虫进行低成本保种方法和利用蒸馏水进行复苏的便捷方法；
[0027]3)该方法的复苏效率高，且不受时间和温度的限制，使虫体密度在72小时达到最大种群密度，且生长状态较好。
附图说明
[0028]图1.本专利技术肾形虫虫株长期保种及快速复苏的方法过程示意图；
[0029]图2.微孔滤膜4℃保种后复苏的生长曲线；
[0030]图3.微孔滤膜常温保种后复苏的生长曲线；
[0031]图4.微孔滤膜不同保种温度及时间的复苏效果差异显著性分析；
具体实施方式
[0032]下面结合附图和实施例对本专利技术作进一步详细的描述，但本专利技术的实施方式不限于此。
[0033]实施例1
[0034]参照图1的制备过程：
[0035]1.材料与方法
[0036]1.1膨胀肾形虫(Colpoda inflata)
[0037]本实验选择了肾形虫属模式物种膨胀肾形虫为实验生物。水陆两生型原生动物，广泛分布于全球的土壤、江河湖泊及海洋等各种生境中，具有特殊的包囊生殖方式，是毒理学和细胞生物学的理想实验材料。
[0038]1.2虫株的培养
[0039]挑取单个细胞，小麦粒培养液，20
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25℃的恒温恒湿培养箱中建立单克隆培养体系，后进行大量纯培养，取对数生长期的虫液进行物种保存。
[0040]1.3虫株的保存
[0041]根据过滤器的型号大小对微孔滤膜和定性滤纸进行裁剪后，将0.22μm微孔滤膜(0.22μm的混合纤维素(MCE)微孔滤膜)平铺于过滤器上，取一定体积的虫液缓缓倾倒在过滤器上，待过滤完成后，用镊子取下滤膜，室温条件自然风干1小时后，将滤膜折叠好置于15ml离心管中，室温和4℃条件分别进行保存。
[0042]1.4虫株的复苏
[0043]在肾形虫种株复苏时，吸取10ml蒸馏水于六孔板中并加入2颗灭菌后的麦粒，将室温和4℃条件下附有虫体的微孔滤膜平铺在六孔板中，于20
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25℃恒温恒湿培养箱中培养96小时，镜检观察并计数。
[0044]1.4数据分析
[0045]将记录所得生长数据利用Excel进行整理，根据下式计算原生动物的种群增长率r＝(ln N
t
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ln N0本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种肾形虫虫株长期保种方法，其他在于，包括：(1)肾形虫的培养，挑取单个细胞进行单克隆培养，培养至对数生长期进行保种；(2)选取0.22μm微孔滤膜作为保种介质；(3)将0.22μm微孔滤膜置于过滤器上，将一定体积的虫液缓缓倾倒在过滤器上，待过滤完成后，取下滤膜，待干后，置于容器中保存。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)包括：可于有机质含量丰富的土壤中采集土样，利用“非淹没培养法”孵化土壤中的肾形虫，96小时后在体式显微镜下利用微吸管挑取肾形虫单个细胞。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)包括：挑取单个细胞后，在24孔板中每孔添加1ml蒸馏水和一颗麦粒，于20～25℃的恒温恒湿培养箱中建立单克隆培养系，72小时后将24孔板各孔的同种肾形虫混合转移至六孔板，每孔倒入10ml蒸馏水并加两颗灭菌后的麦粒，20～25℃的恒温恒湿培养箱中进行大量纯培养72小时，取对数生长期的虫体培养液进行保种。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)包括：将0.22μm微孔滤膜进行裁剪至和过滤装置的型号匹配的尺寸，后将0.22μm滤膜置于超净工作台中进行紫外灭菌20min后再进行保种。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)包括：...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈瑛，郑维彬，任南琪，侯森，郑晓丹，
申请(专利权)人：哈尔滨工业大学深圳，
类型：发明
国别省市：