一种用于骨髓间充质干细胞成骨分化的促进剂制造技术

本发明专利技术提供了一种用于骨髓间充质干细胞成骨分化的促进剂，属于干细胞技术领域。通过实验，本发明专利技术证明在骨髓间充质干细胞中抑制LINC02075的表达能够显著的促进成骨分化相关基因RUNX2、ALP和OCN的mRNA和蛋白表达来促进骨髓间充质干细胞的成骨分化，因此可将其用于骨髓间充质干细胞的成骨分化促进剂。骨髓间充质干细胞的成骨分化促进剂。骨髓间充质干细胞的成骨分化促进剂。

【技术实现步骤摘要】
一种用于骨髓间充质干细胞成骨分化的促进剂
[0001]本案为分案申请，原申请的专利技术名称为长链非编码RNA在干细胞成骨分化和成脂分化中的作用，原申请的申请日为：2020
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06
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22，原申请的申请号为：CN202010575929.2。


[0002]本专利技术属于干细胞
，具体涉及一种用于骨髓间充质干细胞成骨分化的促进剂。

技术介绍

[0003]骨质疏松是一种全身性，机体代谢性的骨骼病变。骨质疏松的主要病理特征为骨量下降，骨微结构受损和骨脆性上升，其主要临床表现为病理性骨折和腰背痛。随着老龄化水平的不断加剧，骨质疏松开始受到越来越多的人的关注。
[0004]骨髓间充质干细胞是一类具有多分化和自我更新能力的干细胞类型，其可以在不同的条件下分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经细胞、成肌细胞等。骨髓间充质干细胞具有易于获取，免疫排斥小，来源途径丰富等优势，因此已被用于临床治疗。人体中，骨髓间充质干细胞的成骨分化和成脂分化之间是一种相互制约的平衡关系，也就是说，成脂分化的发生会抑制骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化，同样成骨分化的发生会抑制骨髓间充质干细胞向脂肪细胞分化。在骨质疏松的发生发展过程中，骨量减少和骨髓中脂肪含量增加与骨髓间充质干细胞成脂分化和成骨分化的失调是相吻合的。因此，通过抑制骨髓间充质干细胞的成脂分化来治疗骨质疏松是切实可行的。
[0005]长链非编码RNA是一类长度大于200bp的非编码RNA，起初，研究人员认为其是基因组转录中的“噪音”，但是随着对其研究的不断深入，研究人员发现长链非编码RNA参与细胞周期调控，胚胎发育以及细胞分化等多种生命活动。现有的研究表明，长链非编码RNA的表达水平异常或者是功能异常与肿瘤、阿兹海默症等多种疾病紧密相关。同时，最近的研究表明，长链非编码RNA与干细胞多潜能的维持与分化紧密相关。目前，关于LINC02075在骨髓间充质干细胞中成脂分化和成骨分化中的相关作用研究尚未见报道。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供长链非编码RNA LINC02075在抑制骨髓间充质干细胞成脂分化和促进骨髓间充质干细胞成骨分化中的应用。
[0007]为实现上述目的，本专利技术提供了如下技术方案：一种抑制骨髓间充质干细胞成脂分化的分子干预靶点，所述分子干预靶点为LINC02075。
[0008]优选地，所述LINC02075的转录本序列如SEQ ID NO.1所示。
[0009]此外，本专利技术提供了LINC02075基因抑制剂在制备骨髓间充质干细胞成脂分化抑制剂中的应用。
[0010]优选地，所述基因抑制剂为siRNA，化学修饰siRNA，shRNA中的一种。
[0011]优选地，所述基因抑制剂为shRNA。
[0012]优选地，所述shRNA的正义链为：5'
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CACCGCTCCTGAAGAAACAGCTTAGCGAACTAAGCTGTTTCTTCAGGAGC
ꢀ‑
3'，所述shRNA的反义链为：5'
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AAAAGCTCCTGAAGAAACAGCTTAGTTCGCTAAGCTGTTTCTTCAGGAGC
ꢀ‑
3'。
[0013]此外，本专利技术提供了LINC02075基因抑制剂在制备骨髓间充质干细胞成骨分化促进剂中的应用。
[0014]优选地，所述基因抑制剂为shRNA，所述shRNA的正义链为：5'
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CACCGCTCCTGAAGAAACAGCTTAGCGAACTAAGCTGTTTCTTCAGGAGC
ꢀ‑
3'，所述shRNA的反义链为：5'
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AAAAGCTCCTGAAGAAACAGCTTAGTTCGCTAAGCTGTTTCTTCAGGAGC
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3'。
[0015]除此之外，本专利技术提供了LINC02075基因抑制剂在制备治疗骨质疏松药物中的应用。
[0016]本专利技术的有益效果在于：本专利技术首次证明长链非编码RNA LINC02075能够显著的抑制骨髓间充质干细胞成脂分化相关基因PPARγ、C/EBPα和AP2来抑制骨髓间充质干细胞成脂分化，同时，抑制LINC02075能够显著的促进成骨分化相关基因OCN、ALP和RUNX2来促进骨髓间充质干细胞成骨分化，从而为进一步开发治疗骨髓疏松药物提供可能。
附图说明
[0017]图1 成脂分化7天和14天时LINC02075的表达水平变化图2 sh
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LINC02075对于LINC02075 mRNA表达水平的抑制效果图3 抑制LINC02075对于成脂分化相关基因PPARγ、C/EBPα和AP2 mRNA水平的影响图4 抑制LINC02075对于成脂分化相关基因PPARγ、C/EBPα和AP2 蛋白水平的影响图5 油红O染色检测抑制LINC02075对于骨髓间充质干细胞成脂分化的影响图6 抑制LINC02075对于成骨分化相关基因OCN、ALP和RUNX2 mRNA水平的影响图7 抑制LINC02075对于成骨分化相关基因OCN、ALP和RUNX2蛋白水平的影响。
具体实施方式
[0018]实施例1荧光定量PCR检测成脂诱导过程中的LINC02075的表达水平1.成脂诱导（1）选取处于对数生长期的第三代人骨髓间充质干细胞（购于Sciencell公司）接种到培养瓶中，加入完全培养基进行培养；（2）当细胞融合度达到70%时，将培养基更换为成脂诱导培养基，每3天进行一次更
换，成脂诱导14天后，提取RNA。
[0019]2.RNA提取分别在第0天，7天和14天提取RNA，每组设置3个对照。
[0020]（1）去除培养基，每孔加入500μL Trizol，反复的吹打细胞，直到形成清亮不粘稠的液体；（2）将混合液转移至1.5ml EP管中，加入100μL氯仿,在振荡器上剧烈震荡充分混匀15s，室温静置5分钟；（3）4℃，低温高速离心机，12000r/min离心15min，小心将上层透明RNA水相转移至新的无RNA酶EP管中；（4）加入等体积的异丙醇混匀，冰上放置10min，13000r/min，4℃离心10min，弃去上清，可见管底白色沉淀；（5）加入400μL 70%酒精温和震荡，12000rpm/min 4℃ 5min，弃去上清液体，管口向下，紧贴滤纸，吸尽管口的液体，室温下干燥5
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10min，检测RNA浓度和质量。
[0021]3.RNA反转录为cDNA（1）反转录体系（2）反转录反应条件37℃ 15min；85℃ 5s；4℃4.荧光定量PCR反应反应体系:反应条件：95℃ 10min；95℃ 20s，60℃ 40s，40个循环；72℃ 5min。
[0022]引物序列
实验结果实验结果如图1所示，从图中可以看出，成脂诱导7天后，LINC02075的相对表达量为3.13本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.LINC02075基因抑制剂在制备骨髓间充质干细胞成骨分化促进剂中的应用，其特征在于，所述LINC02075的转录本序列如SEQ ID NO.1所示；所述基因抑制剂为shRNA，所述shRNA的正义链为：5'
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CACCGCTCCTGAAGAAACAGCTTAGCG...

【专利技术属性】
技术研发人员：ꢀ七四专利代理机构，
申请(专利权)人：青岛思拓新源细胞医学有限公司，
类型：发明
国别省市：