一种人精子膜蛋白SPACA1特异性抗原偶联蛋白与抗体的制备方法技术

一种人精子膜蛋白SPACA1特异性抗原偶联蛋白与抗体的制备方法。N端特异性多肽氨基酸序列为：NYAPPETEDVSNRNC。抗人精子膜蛋白SPACA1抗体制备包括：（1）特异性胞外抗原表位分析与设计；(2)特异性人工多肽合成；（3）合成多肽与载体蛋白交联；（4）制备兔多克隆抗体；（5）收集、分离、纯化获得抗体。本发明专利技术制备的特异性抗人精子膜蛋白SPACA1抗体效价高、亲和力强、特异性好，可在体内和体外与具有天然活性的人精子膜蛋白SPACA1抗原表位发生特异性结合，可用于荧光免疫和酶联免疫吸附实验。该抗体不仅对研究人精子膜蛋白SPAG8蛋白特性、功能、表达谱和相关疾病提供一个重要工具，还在靶向示踪、生物制药和精准治疗等领域具有应用前景。前景。前景。

【技术实现步骤摘要】
一种人精子膜蛋白SPACA1特异性抗原偶联蛋白与抗体的制备方法


[0001]本专利技术涉及一种多肽及其抗体制备方法，该抗体是用于人精子膜蛋白SPACA1蛋白的基础研究的重要工具，还可在靶向示踪、生物制药和精准治疗等领域具有很好的应用前景。

技术介绍

[0002]精子获能是两性生殖过程的重要步骤，获能过程中精子细胞膜从非生育状态转化到生育状态。当精子获能后，精子膜蛋白、糖蛋白、脂质成分和精子质膜通道发生多种分子结构的变化，一方面出现精子头部质膜成分损失，尾部细胞膜改变，发生精子超活化；另一方面精子对卵细胞及其相关结构(颗粒细胞，卵透明带)提供的信号进行反馈并发生顶体反应(AR)。出现顶体受体的激活、顶体膜与精细胞质膜融合、顶体中水解酶的释放、卵细胞外被(透明带)的水解等过程，最终促进精子
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卵母细胞融合。精子顶体区上的这些受体、糖或蛋白质分子可以作为抗原直接产生抗精子抗体(AsAb)，从而妨碍精卵融合，引发男性不育。由于缺乏精子顶体膜蛋白特异性抗原位点和抗体的研究，AsAb引起男性免疫不育症的作用机制尚未明确，因此借助分子生物学、生物信息学和高通量测序等技术的跨学科应用，进一步揭示精子顶体区、颈部和尾部精子表面膜蛋白的特异性抗原位点在两性生殖过程中的作用机制，构建特异性免疫不孕不育靶向治疗方法等一系列的科学问题，是促进健康生育、构筑人口安全的重大需求。
[0003](1)SPACA1的功能：人精子顶体膜相关蛋白1(sperm acrosome membrane
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associated protein 1，SPACA1)基因位于6q15DNA正义链，长度为19,798bp，有8个外显子，具有一个保守结构域，该基因的mRNA有两种亚型：XM_011536160.2和XM_017011335.1。SPACA1蛋白质产物294个氨基酸，分子量32,143Da，是单次跨膜Ⅰ型膜蛋白，主要位于细胞膜。在精子发生过程中，在精子细胞发育的所有阶段的顶体中都能检测到SPACA1，但在顶体形成之前未发现。该蛋白定位于精子细胞和成熟精子的整个顶体的内膜和外膜。有研究显示SPACA1主要在顶体形态发生和精卵结合及融合中起作用。
[0004](2)SPACA1抗体产品的信息：经检索,市场上有SPACA1蛋白的多克隆抗体,但是这些抗体的抗原表位不同且只能进行体外检测。
[0005](3)SPACA1抗体的功能：SPACA1抗体与特发性不孕不育病例具有相关性，该基因表达的蛋白最早通过不育男性的抗精子抗体识别。体外实验显示SPACA1在精子与卵膜结合与融合中发挥生理作用，SPACA1重组蛋白产生的抗体可以抑制人类精子与去透明带仓鼠卵的结合从而阻断体外受精。重组SPACA1抗原与抗精子抗体阳性的不育男性血清有强烈的免疫结合反应，提示SPACA1可能是引起免疫不育的抗原。动物实验显示，SPACA1蛋白在精子头部的形成中起着重要作用，SPACA1基因敲除小鼠的成熟精子是缺乏顶体的圆头精子能够引起不育。

技术实现思路

[0006]本专利技术目的针对可用于免疫不育机制研究的AsAb制备方法和研究工具的不足，提供一种人精子膜蛋白SPACA1特异性多肽、抗原偶联蛋白与抗体的制备方法，不同于体外实验检测抗体，用此多肽制备的抗SPACA1抗体一方面可以通过免疫荧光和酶联免疫吸附实验特异识别组织或细胞中的天然人SPACA1蛋白，另一方面可以借助SPACA1的特异性表面抗原位点进行抗精子抗体介导的免疫不育作用机制的研究，还可以开展靶向示踪、生物制药和精准治疗等方面的研究。
[0007]本专利技术的技术方案
[0008]一种N端人精子膜蛋白SPACA1特异性多肽，其抗原结合位点位于人精子顶体区外膜，多肽序列为人精子膜蛋白SPACA1氨基酸序列中第61位到第74位氨基酸的肽段，并在C端加上半胱氨酸(C)，多肽的氨基酸序列为：NYAPPETEDVSNRNC。
[0009]一种人精子膜蛋白SPACA1特异性抗原偶联蛋白，为合成抗原多肽NYAPPETEDVSNRNC通过交联剂将多肽氨基酸疏基与匙孔血蓝蛋白(KLH)氨基共价交联的混合物。
[0010]本专利技术同时提供了一种抗人精子膜蛋白SPACA1的抗体的制备方法，包括：
[0011]第1步、人精子膜蛋白SPACA1特异性抗原表位的分析与设计；
[0012]利用生物信息软件对蛋白的氨基酸序列进行抗原表位分析，主要评估跨膜片段、多肽活性、亲水性、抗原性等指数。
[0013]第1.1步、使用TMHMM在线预测膜蛋白的跨膜区域；
[0014]登录TMHMM主页面，在“选择文件”弹出框提交FASTA格式SPACA1蛋白序列或将序列粘贴在“OR by pasting sequence(s)in FASTA format:”下方的文本框；out format有三个选项，分别是图形输出(Extensive,with gaphics)；文字输出(Extensive，no graphics)；蛋白逐行显示(One line protein)，默认选项图形化显示；调整完毕后按“submit”键提交并查看预测分析结果。
[0015]第1.2步、使用SignalP 4.1 Server对膜蛋白进行信号肽的预测分析；
[0016]登录SignalP 4.1 Server主页面，在“选择文件”弹出框提交FASTA格式蛋白序列或将序列粘贴在下方的文本框；参数设置Organism group：选择Eukaryotes；D
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cutoff values：选择Default(optimized for correlation)；Graphics output：选择PNG(inline)；Output format：Standard；Method选择Input sequences may include TM regions。参数设置完毕后按“submit”键提交并查看预测分析结果。
[0017]第1.3步、使用ExPASY
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ProtScale对膜蛋白进行疏水性的预测分析；
[0018]登录ExPASY
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ProtScale主界面，在“Enter a UniProtKB/Swiss
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Prot or UniProtKB/TrEMBL accession number(AC)”文本框内输入蛋白序列ID number；或将FASTA格式蛋白序列粘贴在“Or you can paste your own sequence in the box below:”的文本框；参数设置选择默认设置，设置完毕后按“Submit”提交并查看预测分析结果。
[0019]第2步、人精子膜蛋白SPACA1特异性抗原偶联蛋白的制备和纯化；
[0020]第2.1步、人工多肽的合成；
[0021]采用多肽自动合成仪合成纯化，并采用质谱分析和高效液相色谱分析法进行纯度鉴定，纯度大于为本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种N端人精子膜蛋白SPACA1特异性多肽，其特征在于抗原结合位点位于人精子顶体区外膜，多肽序列为人精子膜蛋白SPACA1氨基酸序列中第61位到第74位氨基酸的肽段，并在C端加上半胱氨酸(C)，多肽的氨基酸序列为：NYAPPETEDVSNRNC。2.一种人精子膜蛋白SPACA1特异性抗原偶联蛋白，其特征在于为合成抗原多肽NYAPPETEDVSNRNC通过交联剂将多肽氨基酸疏基与匙孔血蓝蛋白(KLH)氨基共价交联的混合物。3.一种抗人精子膜蛋白SPACA1的抗体制备方法，其特征在于包括：1)、人精子膜蛋白SPACA1特异性抗原表位的分析与设计；2)、人精子膜蛋白SPACA1特异性抗原偶联蛋白的制备和纯化；3)、制备人工免疫原免疫动物；4)、收集抗体血清；5)、饱和硫酸铵法分离纯化抗人精子膜蛋白SPACA1IgG抗体；6)、酶联免疫吸附实验鉴定血清抗体与天然人SPACA1蛋白结合效价；7)、细胞免疫荧光染色定位精子表面SPACA1蛋白分布。4.根据权利要求3所述的抗体制备方法，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：王江，牛远杰，李刚，郭战军，沈冲，刘子豪，陈昱彤，米洪霖，辛钟成，
申请(专利权)人：天津市泌尿外科研究所，
类型：发明
国别省市：