一种肌酐竞争抗原及其制备方法以及检测肌酐竞争抗原稳定性的方法技术

本发明专利技术提供了一种肌酐竞争抗原及其制备方法以及检测肌酐竞争抗原稳定性的方法，包括具有式(Ⅳ)所示的结构式：其中，R为

【技术实现步骤摘要】
一种肌酐竞争抗原及其制备方法以及检测肌酐竞争抗原稳定性的方法


[0001]本专利技术涉及肌酐衍生物制备
，具体涉及一种肌酐竞争抗原及其制备方法以及检测肌酐竞争抗原稳定性的方法。

技术介绍

[0002]肌酐是一种低分子量的含氮化合物，是人体内肌酸代谢的终产物。肌酐是临床常规肾功能指标之一，临床上主要用于严重肾小球病变引起的肾功能不全、肾炎、尿毒症等肾脏疾病的诊断和疗效观察等。血清肌酐升高意味着肾功能的损害，是了解肾脏功能的重要指标，同时对冠状动脉病变程度、高血压、糖尿病等有可靠的诊断价值；尿肌酐排出量可作为肌肉量的指标，肌酐的产生量比较恒定，当肾功能损伤不严重时，尿中肌酐的排泄量少受尿液浓缩和稀释的影响，故尿中肌酐浓度的测定常用作尿中其他物质排泄浓度的参照物。肌酐作为重要的肾功能指标，其含量检测为体外诊断，与供体无接触，无不良、致死报告，操作简单、快速，可广泛应用于临床，其临床应用的安全性和可靠性已得到验证。
[0003]CN201410799524.1公布了肌酐衍生物、肌酐免疫原及其特异性抗体与肌酐检测试剂盒，其特点在于肌酐衍生物具有如式(Ⅰ)示结构：
[0004][0005]其中R为
‑
(CH2)n
‑
COO
‑
,n为1至20之间的整数。肌酐免疫原通过酯键与特定载体连接，具有高免疫原性，且免疫诱导动物所产生的抗体特异性高，与肌酐的特异性结合能力强，通过均相酶免疫检测技术能够实现全自动生化分析仪上对肌酐的高通量、快速化检测。但是这种依靠酯键相连的肌酐免疫原不够稳定，容易在水溶液中水解。
[0006]2、现有技术中还有通过九步的合成，合成了一种肌酐免疫原及其制备方法以及检测肌酐免疫原稳定性的方法，该肌酐衍生物具有如式(Ⅱ)所示结构：
[0007][0008]作者将该化合物与蛋白偶联，得到了肌酐免疫原，进行活兔免疫实验，获得了肌酐
的特异性抗体，并将偶联后的蛋白作为竞争抗原，应用ELISA法制作了肌酐的检测试剂盒。但是通过该肌酐免疫原获得的抗体滴度低，进一步应用的可能性较低。同时该化合物的合成步骤较长，过程中需要NaN3、H2等危化品，工业化难度较大。
[0009]3、在2000年发表了文章，合成了一种肌酐免疫原及其制备方法以及检测肌酐免疫原稳定性的方法，该肌酐衍生物结构如式(Ⅲ)所示：
[0010][0011]并将该肌酐衍生物与蛋白偶联，获得了一种肌酐免疫原，进行小鼠的活体免疫实验，获得了高特异性的肌酐抗体。文中提到，将肌酐衍生物通过化学键将亲水酰肼膜改性，作为竞争抗原，与获得的肌酐抗体以及抗IgG葡萄糖氧化酶组成肌酐检测传感器。但是这种肌酐检测传感器在使用过程中操作繁琐，等待时间较长，搭配使用的仪器不是市场常见的仪器，不利于产品上市推广。
[0012]CN201410799524.1公布的专利技术中，肌酐免疫原是通过酯键将肌酐衍生物和特定载体连接，通过这种方法获得的肌酐免疫原结构不稳定容易在水溶液中水解，使后续的反应效率低，造成原料的浪费，成本的提高。
[0013]通过九步合成的肌酐衍生物步骤较长，合成条件苛刻，过程中需使用NaN3、H2等危化品，工业化难度较大，不利于量产。且该结构与蛋白偶联后获得的肌酐免疫原在进行活兔试验后获得的抗体滴度低，不利于进一步应用。
[0014]在2000年发表了文章中制造了一种新的肌酐检测的传感器，但是该装置操作繁琐，等待时间长，且搭配使用的仪器为实验室自制，不是市场常见的仪器，不利于产品的上市推广。为此，我们提出一种肌酐竞争抗原及其制备方法。由于肌酐是一个分子量为113g/mol的小分子，它必须与载体蛋白偶联才能产生免疫原性。因此，我们提出了一种肌酐改性后与蛋白偶联的新结构，以期该结构可作为竞争抗原，应用现有常见方法，可以用市场常见仪器测试肌酐含量。

技术实现思路

[0015]本专利技术的目的在于解决或者至少缓解现有技术中存在的问题。
[0016]为实现以上目的，本专利技术通过以下技术方案予以实现：
[0017]一种肌酐竞争抗原，具有式(Ⅳ)所示的结构式：
[0018][0019]其中，R为
‑
(CH2)n
‑
CO
‑
NH
‑
，n为4
‑
20之间的整数，且载体为具有免疫原性的蛋白。
[0020]可选地，R为
‑
(CH2)n
‑
CO
‑
NH
‑
，优选n为4
‑
10之间的整数。
[0021]可选地，所述具有免疫原性的蛋白包括但不限于牛血清白蛋白(BSA)、鸡卵白蛋白(OVA)、钥孔血蓝蛋白(KLH)、甲状腺球蛋白、酪蛋白。
[0022]一种肌酐竞争抗原的制备方法，包括：制备肌酐衍生物；以及将所述肌酐衍生物与载体连接，得到所述肌酐竞争抗原。
[0023]可选地，所述肌酐衍生物的制备过程包括：
[0024]步骤S1、将60
‑
100mmol的肌酐悬浮到50mL的二甲基甲酰胺(DMF)中，在80
‑
95℃下逐滴加入80
‑
110mmol 5
‑
溴戊酸乙酯，在80
‑
95℃下反应5h；反应结束后，冷却到室温，加入300
‑
600mL乙酸乙酯结晶，过滤，用丙酮清洗滤渣，得到出产物，用真空干燥箱除去残留溶剂，称量得到产物化合物1；
[0025]步骤S2、将化合物1加入到50mL甲醇中，加入50mmol KOH，室温搅拌1h，旋蒸去除甲醇，用乙醇溶解残渣，过滤析出的盐，旋蒸除去乙醇，得到化合物2；
[0026]步骤S3、在100mL纯水中加入1.1eq的NaOH以及化合物2，加热回流5h；反应结束后，蒸发掉乙醇，加入浓HCl溶液，将pH调至3左右，蒸发掉溶剂，得到淡黄色粘稠物质；
[0027]步骤S4、通过硅胶柱提纯，得到所述肌酐衍生物。
[0028]所述肌酐衍生物与载体蛋白的偶联包括如下步骤：
[0029]步骤S1、在MES缓冲液中，以1
‑
乙基
‑
(3
‑
二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)、N
‑
羟基硫代琥珀酰亚胺(sulfo
‑
NHS)活化肌酐衍生物；
[0030]步骤S2、向S1中制备好的混合液中加入牛血清白蛋白(BSA)的碳酸盐缓冲溶液(100mM，pH＝8.5,)，过夜；
[0031]步骤S3、用超滤管离心反应液，收集下清液，在超滤管中加入50mL的PBS缓冲液，继续离心，重复以上步骤三次，获得蛋白浓缩液以及四次离心的下清收集液，该蛋白浓缩液即为所述肌酐竞争抗原。
[0032]检验肌酐竞争抗原稳定性的方法，包括如下步骤：
[0033]步骤S1、通过DNBA法测试肌酐衍生物与蛋白本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种肌酐竞争抗原，其特征在于：具有式(Ⅳ)所示的结构式：其中，R为
‑
(CH2)n
‑
CO
‑
NH
‑
，n为4
‑
20之间的整数，且载体为具有免疫原性的蛋白。2.如权利要求1所述的一种肌酐竞争抗原，其特征在于：所述R为
‑
(CH2)n
‑
CO
‑
NH
‑
，优选的，n为4
‑
10。3.如权利要求1所述的一种肌酐竞争抗原，其特征在于：所述具有免疫原性的蛋白，包括但不限于牛血清白蛋白(BSA)、鸡卵白蛋白(OVA)、钥孔血蓝蛋白(KLH)、甲状腺球蛋白、酪蛋白。4.如权利要求1所述的一种肌酐竞争抗原的制备方法，其特征在于，包括：制备肌酐衍生物；以及将所述肌酐衍生物与载体连接，得到所述肌酐竞争抗原。5.如权利要求4所述的一种肌酐竞争抗原的制备方法，其特征在于，包括：所述肌酐衍生物的制备过程包括：步...

【专利技术属性】
技术研发人员：陆秀萍，邹丽洁，彭伟，李俊，林滔，刘岩，
申请(专利权)人：无锡博慧斯生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：