用于培养软骨及其球状体的方法技术

本发明专利技术涉及用于增殖或富集软骨细胞并且提供其球状体的方法，其中所述球状体对于自体软骨细胞植入(ACI)产品来说是有用的。因此，本发明专利技术特别地涉及从关节软骨来产生球状体，以及其用途。其用途。其用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于培养软骨及其球状体的方法
[0001]说明书
[0002]本专利技术涉及用于增殖或富集软骨细胞并且提供其球状体的方法，其中所述球状体对于自体软骨细胞植入(autologous chondrocyte implantation；ACI)产品来说是有用的。因此，本专利技术特别地涉及从关节软骨来产生球状体，以及其用途。
[0003]虽然关节软骨显示出值得注意的复原力，但是该组织不能或几乎不能修复自身，并且未治疗的损害可以导致例如骨关节炎。这种低的进行自发再生的潜力已经导致了细胞疗法(例如，自体软骨细胞植入(ACI))的发展，以力求提供功能性的和无痛的关节软骨缺损的修复。但是，该类型的技术无法保证软骨再生，并且以前没有任何足够的长期研究。因此，存在高的对于用于软骨再生的方法的需求，例如在具有创伤性损害或甚至具有软骨变性症状的年轻的有活力的患者中。
[0004]已经用从牛、兔子或绵羊中分离出的软骨细胞进行了许多研究。但是，无法将所获得的数据和该类型的基于动物的概念转移至人的情形。用人软骨细胞的详细生物化学和分子研究受到一系列因素的阻碍，例如与非常少数目的在活组织检查中可用的细胞相联系的人组织的可得性不足，经培养的软骨细胞的有限的增殖能力和高的表型不稳定性。
[0005]软骨细胞是一种来源于成软骨细胞并定居在软骨组织中的细胞。与细胞间质(细胞外基质(ECM))一起，软骨细胞构成软骨的主要组成部分。
[0006]天然关节软骨具有相对于关节组织的湿重而言大约60
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80％的水的所形成的细胞外基质的组成。高的含水量对于软骨组织的机械负荷能力来说是重要的，并且与蛋白聚糖一起对于“海绵效应”来说是重要的。除了水之外，天然软骨关节还包含基质的结构大分子，例如胶原、蛋白聚糖和非胶原蛋白质。在该情况下，结构大分子总计为关节软骨组织的湿重的大约20
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40％。
[0007]已经知道，例如通过模拟胚胎发育的某些过程，例如在琼脂糖基底上三维地培养人软骨细胞，从而产生在其分化状态方面优于单层细胞并且具有例如软骨样特性的细胞聚集体。尽可能准确地反映了天然关节软骨组织的这些特性以胶原II(透明软骨的细胞外基质中的主要结构蛋白质)、蛋白聚糖(例如，聚集蛋白聚糖)和细胞内的软骨细胞特异性的蛋白S100的表达为特征。另外，希望的是，在以单层培养物的细胞扩增期期间必然被上调的胶原I的表达在细胞聚集体中重又降低，这是因为这种蛋白质在天然关节软骨中实际上不存在。自2002年以来，如此产生的细胞聚集体(球状体)已例如由申请人(co.don AG)提供以便因此主要治疗由损伤引起的较小的软骨缺损。为此，从患者中取出天然关节软骨组织，并且将从中分离出的细胞在扩增和3D培养后作为球状体进行移植。一种自体软骨细胞植入(ACI)产品称为
[0008]以三维细胞聚集体的形式(特别是以称为球状体的形式)的人细胞的培养已经被批准用于在人中的临床应用，例如作为自体软骨移植物(DE 100 13 223)。DE 100 13 223涉及用于在体外从骨干细胞、软骨干细胞或间充质干细胞产生三维软骨组织和骨组织的方法。在该情况下，将细胞首先以单层培养物进行培养，然后以悬浮液进行培养，直至产生细胞聚集体，其包含至少40体积％的细胞外基质，在其中包埋有经分化的细胞。在所述方法
中，通过将细胞在包覆有琼脂糖的细胞培养容器中培养至少1
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2周来产生细胞聚集体。
[0009]US 7 887 843 B2公开了一种用于在体外产生三维软骨组织和骨组织的方法，其中通过将1
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105个细胞培养至少两周来从骨干细胞、软骨干细胞或间充质干细胞产生球状体。根据US 7 887 843 B2所产生的球状体在一周后具有500
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700μm的直径。按照该方法，将1
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105或2
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105个软骨细胞培养5天、2周、1个月、2个月和3个月以便产生球状体。
[0010]根据本专利技术，将源自患者的组织活组织检查物用作起始材料。根据常规方法从活组织检查物中分离出构建组织的细胞，其中使用组织的酶促消化、迁移或识别靶细胞的试剂。
[0011]根据本专利技术，然后使这些细胞经历静止培养，其中在细胞培养容器(特别地具有疏水表面)中通过使用常规培养基，将细胞首先以基底支持的单层培养物(二维的)进行培养，然后在悬浮液中以没有基底的简单方式进行培养，直至形成三维细胞聚集体，其包括至少40体积％和直至最大95体积％的细胞外基质(ECM)，其具有包埋在其中的经分化的细胞。在本专利技术的意义下将如此形成的聚集体称为球状体。
[0012]作为根据本专利技术的细胞培养容器，在悬浮液中的培养步骤需要使用具有疏水的(即防粘附的)表面，例如聚苯乙烯或Teflon等的那些细胞培养容器。具有非疏水表面的细胞培养容器可以优选地通过用琼脂或琼脂糖进行包覆来疏水化。不需要进一步的添加剂。优选地，使用96
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孔平板作为细胞培养容器。
[0013]值得注意的是，整合在根据本专利技术而产生的球状体中的细胞存活，并且甚至在培养后期之后内部的细胞也不坏死。随着培养时间增加，在聚集体内部的细胞经历分化以形成由ECM、经分化的细胞和外周增殖区带组成的球状体。形成具有所包埋的细胞的组织特异性基质的过程与在身体内组织形成或新生和再组织的过程高度相似。在细胞培养物中进行分化期间，由于组织特异性基质的形成，所聚集的细胞的间隔增加。组织组织学在球状体内部发展，这与天然组织高度相似。如在天然软骨中那样，在球状体内部的细胞仅通过扩散被供给营养物。在球状体产生的进一步过程中，在球状体的边界处形成能够增殖和迁移的细胞的区带。该区带是无价地有利的，因为在球状体掺入到缺损中之后，位于该外周区带中的细胞能够迁移以与周围组织进行主动接触和/或使得在体外产生的组织能够整合到其环境中。因此，所产生的组织特异性细胞聚集体出色地适合于在组织缺损的治疗中和在组织的体外和体内新生中使用。
[0014]但是，本专利技术的一个目标是改进已知的方法和至此为止可获得的球状体，特别是减少非应答者或治疗失败的患者或患者群体的结果并且提供用于更高患者临床安全性的方法。这样的非应答者患者可以通过相比于手术前情形而言8
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10个点的所谓的KOOS值变化来鉴定(Roos EM,Lohmander LS.The Knee injury and Osteoarthritis Outcome Score(KOOS):from joint injury to osteoarthritis.Health Qual Life Outcomes 2003,1:64)。
[0015]令人惊讶地，专利技术人从一项包括120名患者的研究(NCT01225575和NCT0122259)中得出结论，与方法相关的运作范围或过程参数对于球状体的效力具有有价值的影响。
[0016]因此，作为基础的技术问题通过至少一个声索项而得到解决，其中培养时间是一个关键特征。
[001本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.用于增殖或富集软骨细胞并且提供其球状体的方法，所述方法包括下列步骤：a)从人或动物来源的组织中分离出软骨细胞，b)以扩展单层(2D)的方式来培养来自a)的细胞，其中所述单层被放置于基底上，c)取来自a)的单层并且在3D环境中在悬浮液中培养所述细胞，d)其中步骤b)和步骤c)的总培养时间等于或小于55天，其是从步骤a)的开始时间起进行计算的，并且其中步骤b)的持续时间大于10天，e)选择所获得的球状体。2.根据权利要求1的方法，其中步骤b)的持续时间小于38天，和/或步骤c)的持续时间小于28天。3.根据权利要求1的方法，其中步骤b)的持续时间大于16天且小于38天。4.根据权利要求1的方法，其中步骤b)的持续时间等于或小于16天。5.根据权利要求1的方法，其中所述球状体由多于3,000个细胞组成。6.根据权利要求1的方法，其中所述球状体由在3,000至200...

【专利技术属性】
技术研发人员：C，
申请(专利权)人：科东股份公司，
类型：发明
国别省市：