樱桃谷鸭成纤维细胞系及其构建方法与应用技术

本发明专利技术属于生物技术领域，公开了樱桃谷鸭成纤维细胞系及其构建方法与应用。该樱桃谷鸭成纤维细胞系，名称为樱桃谷鸭成纤维细胞yDEF，于2021年11月4日保藏于位于中国.武汉.武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2021288，目前已传至85代，该细胞表面平滑、饱满，无呈梭形的成纤维状细胞，形态统一；且细胞形状呈多边形并排列紧密；病毒敏感性试验显示，该樱桃谷鸭成纤维细胞系对禽流感病毒、法氏囊病毒、鸭呼肠孤病毒、禽腺病毒、新城疫病毒和鸭肝炎病毒敏感；该细胞系可用于培养、分离、检测禽类病毒，制备禽类疫苗，筛选用于预防或治疗禽类病毒感染所致的疾病的药物。物。

【技术实现步骤摘要】
樱桃谷鸭成纤维细胞系及其构建方法与应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及樱桃谷鸭成纤维细胞系及其构建方法与应用。

技术介绍

[0002]在各类禽病中，传染性疾病仍是危害禽类养殖业最为严重的疾病，其中尤以病毒性传染病为甚。以H5、H7和H9等亚型禽流感为代表的高致病性禽流感对禽类养殖造成了严重影响，H5N6禽流感病毒是禽流感病毒的一种新亚型，是禽流感病毒H5N1和H6N6重配后“生”出来的流感病毒，对家禽具有高致病性。此外，在养鸡业中，鸡新城疫、鸡传染性支气管炎、鸡传染性法氏囊、鸡传染性关节炎频发，养鸭业中较为流行的鸭细小病毒病、鸭病毒性肝炎、鸭呼肠孤病毒病，以及鸭副粘病毒病等新型疫病也严重制约着畜禽业的发展。
[0003]疫苗免疫是目前有效预防禽病大流行的手段，国内禽类疫苗的生产主要依靠传统的“鸡胚法”工艺实现。该工艺培养周期长、操作步骤繁琐、生产成本高，大规模生产时存在鸡胚质量不稳定及潜在外源病毒污染问题，收获完成后废胚难以无害化处理，存在病毒扩散风险和污染环境问题。因此，传代细胞系取代鸡胚生产疫苗是大势所趋。随着细胞培养技术的不断发展，细胞基质成为病毒疫苗研发的重要材料。现有报道与研究用于疫苗生产的成熟细胞系，包括Vero，MDCK，Marc145等哺乳类动物细胞，然而，现有的细胞源细胞疫苗主要采用异源细胞作为细胞基质进行生产，免疫原性较差。
[0004]目前禽类细胞的研发与成果较少，鸭源细胞系更少。而鸭类病毒的分离多是通过番鸭胚来分离，但是由于目前国内外尚无商品化的无特定病原体(Specific pathogen Free,SPF)番鸭胚，用其分离鸭类病毒存在内源病毒干扰等情况，影响病毒的分离。为了更好有效的分离到鸭类病毒，及早检测出病毒，预防疾病爆发，许多国内外的学者都在进行禽源细胞系的研究。因此，分离禽类原代细胞，建立可永生化的细胞系，成为突破细胞源疫苗生产的关注点。现在急需建立一株能够稳定快速传代的樱桃谷鸭成纤维细胞系，并应用到多种禽类病毒上。

技术实现思路

[0005]本专利技术第一方面的目的，在于提供一种樱桃谷鸭成纤维细胞系。
[0006]本专利技术第二方面的目的，在于提供第一方面的樱桃谷鸭成纤维细胞系的构建方法。
[0007]本专利技术第三方面的目的，在于提供第一方面的樱桃谷鸭成纤维细胞系的应用。
[0008]本专利技术第四方面的目的，在于提供一种培养病毒的方法。
[0009]本专利技术第五方面的目的，在于提供一种病毒疫苗的制备方法。
[0010]本专利技术第六方面的目的，在于提供一种病毒疫苗。
[0011]为了实现上述目的，本专利技术所采取的技术方案是：
[0012]本专利技术的第一个方面，提供一种樱桃谷鸭成纤维细胞系，名称为樱桃谷鸭成纤维
细胞yDEF，于2021年11月4日保藏于位于中国.武汉.武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2021288。
[0013]本专利技术的第二个方面，提供本专利技术第一方面的樱桃谷鸭成纤维细胞系的构建方法，包括如下步骤：1)将樱桃谷鸭鸭胚的躯干组织与胶原酶混合，进行第一次消化，得到初步消化的组织碎块，将初步消化的组织碎块与胰酶混合，进行第二次消化，得到第二组织碎块；2)将第二组织碎块研磨，固液分离，得到细胞，加入红细胞裂解液，固液分离，得到细胞沉淀，用含9.5～10.5％胎牛血清的MEM培养基重悬细胞沉淀，培养，细胞贴壁生长后，更换含7.5～8.5％胎牛血清的MEM培养基培养，细胞长成单层后，用胰酶消化，然后按0.1～1个细胞/孔的密度接种到培养板中，取单个细胞孔中的细胞生长成克隆团，得到樱桃谷鸭成纤维细胞单细胞株；3)用胰酶消化樱桃谷鸭成纤维细胞单细胞株，继代培养，细胞长成单层后，用胰酶消化，固液分离，得到细胞沉淀，用4～6％胎牛血清的MEM培养基进行传代培养，得到降血清驯化的樱桃谷鸭成纤维细胞；4)用含2～3％胎牛血清的MEM培养基传代培养降血清驯化的樱桃谷鸭成纤维细胞，得到樱桃谷鸭成纤维细胞。
[0014]优选地，步骤1)中所述樱桃谷鸭鸭胚的躯干组织的制备方法如下：去除樱桃谷鸭胚蛋的蛋壳，取出胚体，去除胚胎头部、尾部、内脏及血管等组织，得到樱桃谷鸭鸭胚的躯干组织。
[0015]优选地，步骤1)中所述胶原酶包括四型胶原酶、胎牛血清白蛋白、青霉素、链霉素和HANKS液。
[0016]优选地，步骤1)中所述第一次消化的条件为36～38℃、12～18rpm消化10～20min。
[0017]优选地，步骤1)中所述第二次消化的条件为20～30℃消化15～25min。
[0018]优选地，步骤2)中所述第二组织碎块的大小为1～2cm3/个。
[0019]优选地，步骤3)所述继代培养的代次为8～12。
[0020]优选地，步骤3)所述继代培养的条件为36～38℃，4～6％CO2。
[0021]优选地，步骤3)所述传代培养的代次为4～6。
[0022]优选地，步骤4)所述传代培养的代次为8～12。
[0023]优选地，所述传代培养的条件为36～38℃，4～6％CO2。
[0024]本专利技术的第三个方面，提供本专利技术第一方面的樱桃谷鸭成纤维细胞系的应用：
[0025]本专利技术第一方面的樱桃谷鸭成纤维细胞系在培养禽类病毒中的应用；
[0026]本专利技术第一方面的樱桃谷鸭成纤维细胞系在制备培养禽类病毒的产品中的应用；
[0027]本专利技术第一方面的樱桃谷鸭成纤维细胞系在分离禽类病毒中的应用；
[0028]本专利技术第一方面的樱桃谷鸭成纤维细胞系在制备分离禽类病毒的产品中的应用；
[0029]本专利技术第一方面的樱桃谷鸭成纤维细胞系在非诊断治疗目的地检测禽类病毒中的应用；
[0030]本专利技术第一方面的樱桃谷鸭成纤维细胞系在制备检测禽类病毒的产品中的应用；
[0031]本专利技术第一方面的樱桃谷鸭成纤维细胞系在制备禽类疫苗中的应用；
[0032]本专利技术第一方面的樱桃谷鸭成纤维细胞系在药物筛选中的应用，所述药物为用于预防或治疗禽类病毒感染所致的疾病的药物。
[0033]优选地，所述禽类病毒为禽流感病毒、法氏囊病毒、鸭呼肠孤病毒、禽腺病毒、新城疫病毒和鸭肝炎病毒中的至少一种。
[0034]优选地，所述禽流感病毒为禽流感H5亚型病毒和禽流感H7亚型病毒中的至少一种；进一步为H5
‑
rFJ56和H7
‑
rGD76中的至少一种。
[0035]优选地，所述法氏囊病毒为IBDV
‑
X1。
[0036]优选地，所述鸭呼肠孤病毒为NDRV
‑
DH13。
[0037]优选地，所述禽腺病毒为FAdV
‑
4。
[0038]优选地，所述新城疫病毒为LaSota。
[0039]优选地，所述鸭肝炎病毒为鸭肝炎CH60弱毒苗。
[0040]本专利技术的第四个方面，提供本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种樱桃谷鸭成纤维细胞系，名称为樱桃谷鸭成纤维细胞yDEF，于2021年11月4日保藏于位于中国.武汉.武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2021288。2.权利要求1所述的樱桃谷鸭成纤维细胞系的构建方法，包括如下步骤：1)将樱桃谷鸭鸭胚的躯干组织与胶原酶混合，进行第一次消化，得到初步消化的组织碎块，将初步消化的组织碎块与胰酶混合，进行第二次消化，得到第二组织碎块；2)将第二组织碎块研磨，固液分离，得到细胞，加入红细胞裂解液，固液分离，得到细胞沉淀，用含9.5～10.5％胎牛血清的MEM培养基重悬细胞沉淀，培养，细胞贴壁生长后，更换含7.5～8.5％胎牛血清的MEM培养基培养，细胞长成单层后，用胰酶消化，然后按0.1～1个细胞/孔的密度接种到培养板中，取单个细胞孔中的细胞生长成克隆团，得到樱桃谷鸭成纤维细胞单细胞株；3)用胰酶消化樱桃谷鸭成纤维细胞单细胞株，继代培养，细胞长成单层后，用胰酶消化，固液分离，得到细胞沉淀，用4～6％胎牛血清的MEM培养基进行传代培养，得到降血清驯化的樱桃谷鸭成纤维细胞；4)用含2～3％胎牛血清的MEM培养基传代培养降血清驯化的樱桃谷鸭成纤维细...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱辉，邵宝顺，张梓鸿，盛圆贤，张久鑫，
申请(专利权)人：广东省华晟生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：