诱导骨骼肌卫星细胞生成脂滴的方法技术

本发明专利技术属于细胞技术领域，具体涉及一种诱导骨骼肌卫星细胞生成脂滴的方法。所述方法包括以下步骤：从刚出生1

【技术实现步骤摘要】
诱导骨骼肌卫星细胞生成脂滴的方法


[0001]本专利技术属于细胞
，具体涉及一种诱导骨骼肌卫星细胞生成脂滴的方法。

技术介绍

[0002]肉类生产是畜牧业的重要组成部分，随着生活水平的不断提高，肉品的需求量与日俱增，如何提高肉类生产水平已成为科技工作者的重要任务(“骨骼肌分泌对猪肌肉生长代谢的调节”，陈杰，全国动物生理生化第十次学术交流会论文摘要汇编，2008年，第10页摘要第1-2行，公开日2009年6月10日)。
[0003]然而，现有的猪的肉质品质不佳。

技术实现思路

[0004]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种诱导骨骼肌卫星细胞生成脂滴的方法。
[0005]为实现上述目的，本专利技术的技术方案为：
[0006]诱导骨骼肌卫星细胞生成脂滴的方法，包括以下步骤：
[0007]从刚出生1-5d的仔猪背肌中采集骨骼肌卫星细胞，并纯化，纯化后的骨骼肌卫星细胞待贴壁汇合到60％-70％时，进行生脂诱导。
[0008]进一步，所述纯化采用差速贴壁方法。
[0009]进一步，所述生脂诱导包括以下步骤：
[0010]第1-2d，向基础培养基中添加地塞米松、胰岛素、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤和双抗，培养2d；
[0011]第3-4d，向基础培养基中添加胰岛素、罗格列酮和双抗，培养2d；
[0012]第5-6d，向基础培养基中添加地塞米松、胰岛素、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤和双抗，培养2d；
[0013]第7-8d，向基础培养基中添加胰岛素、罗格列酮和双抗，培养2d；
[0014]第9-10d，基础培养基中添加葡萄糖和双抗，培养2d。
[0015]进一步，所述基础培养基采用DMEM/F12培养基。
[0016]进一步，第1-2d，向基础培养基中添加0.5-1μmol/L地塞米松、5-10μg/mL胰岛素、 0.1-0.5mmol/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤和1％-1.5％双抗，培养2d，所述百分比为体积百分比。
[0017]进一步，第3-4d，向基础培养基中添加5-10μg/mL胰岛素、5-10uM罗格列酮和1％-1.5％双抗，培养2d，所述百分比为体积百分比。
[0018]进一步，第5-6d，向基础培养基中添加0.5-1μmol/L地塞米松、5-10μg/mL胰岛素、 0.1-0.5mmol/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤和1％-1.5％双抗，培养2d，所述百分比为体积百分比。
[0019]进一步，第7-8d，向基础培养基中添加5-10μg/mL胰岛素、5-10uM罗格列酮和1％-1.5％双抗，培养2d，所述百分比为体积百分比。
[0020]进一步，第9-10d，向基础培养基中添加5-10mM葡萄糖和1％-1.5％双抗，培养2d，所述百分比为体积百分比。
[0021]本专利技术的有益效果在于：
[0022]本专利技术的方法能够有效地诱导猪骨骼肌卫星细胞生成脂滴。
[0023]采用本专利技术的方法，猪骨骼肌卫星细胞生脂效果明显，从而能够有效提高猪肉质品质。
[0024]本专利技术的方法简单，操作便捷。
附图说明
[0025]图1为实施例1得到的纯的骨骼肌卫星细胞的形态；
[0026]图2为实施例2的PAX-7荧光染色图和细胞核染色图，其中2A和2B分别为荧光染色图(*10)和细胞核染色图(*10)；
[0027]图3为实施例4的油红O染色结果图；其中，3A和3B分别为2d(*10)和2d(*20) 的油红O染色结果图；
[0028]图4为实施例4的油红O染色结果图；其中，4A和4B分别为4d(*10)和4d(*20) 的油红O染色结果图；
[0029]图5为实施例4的油红O染色结果图；其中，5A和5B分别为6d(*10)和6d(*20) 的油红O染色结果图；
[0030]图6为实施例4的油红O染色结果图；其中，6A和6B分别为8d(*10)和8d(*20) 的油红O染色结果图；
[0031]图7为实施例4的油红O染色结果图；其中，7A和7B分别为10d(*10)和10d(*20) 的油红O染色结果图。
具体实施方式
[0032]所举实施例是为了更好地对本专利技术的内容进行说明，但并不是本专利技术的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述
技术实现思路
对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本专利技术的保护范围。
[0033]以下DMEM/F12培养基、胎牛血清FBS、L-Glutamax和Non-Essentia Amino Acids Solution来自美国Gibco公司；
[0034]以下基础成纤维生长因子bFGF来自上海碧云天生物技术有限公司；
[0035]以下鸡胚提取物CEE来自美国Gemini公司；
[0036]以下地塞米松、IBMX、胰岛素、罗格列酮、双抗、多聚赖氨酸、油红O、山羊抗鼠Pax7、荧光鼠源二抗和葡萄糖来自Solarbio公司。
[0037]实施例1
[0038]猪骨骼肌卫星细胞的获得，具体步骤如下：
[0039]宰杀刚出生的小猪，快速采取每一个体的半键肌以及背肌，并立即置于Hanks液中、包装后做下一步处理；
[0040]净台中切取所需骨骼肌，用含有1％双抗的PBS清洗，尽可能去除脂肪、肌键、肌膜等结缔组织；
[0041]剪碎至2mm3左右移入离心管后PBS反复吹打3次，自然沉降5分钟，弃上清液；加入0.2％胶原酶，37℃水浴消化50min，每隔5min震荡一次，结束后用PBS清洗三次，于 1000r/min转速下离心10min，弃上清液；然后用适量的0.25％胰蛋白酶于37％水浴消化 20min，每隔5min震荡一次，消化结束后立即加入等体积培养基(DMEM/F12+20％FBS+ 1％双抗)终止消化，依次经过100目、200目和400目细胞筛过滤，将过滤后的悬液于1000r/min 转速下离心10min，弃上清液，沉淀后的细胞用生长培养基接种于细胞培养皿中；将消化后所得细胞悬液加入培养皿中，于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养(所用每100ml培养基成分为：80％DMEM/F12、20％FBS、0.5％CEE、1％GlutaMax，1％NEAA，1％双抗，2.5ul bFGF) 2h后，然后缓慢吸出培养液并加到新的预铺多聚赖氨酸的培养皿中，12h后吸出培养液，再加到新的培养瓶中，即可得到纯的骨骼肌卫星细胞，其形态如图1所示。
[0042]由图1可知，骨骼肌卫星细胞呈长梭形。
[0043]实施例2
[0044]将实施例1得到的纯的骨骼肌卫星细胞在4wt％多聚甲醛细胞固定液中固定15分钟后，用0.25％TritonX-100进行细胞通透，随后用PBS漂洗3次，再加入3wt％BSA进行封闭1h，加入一抗PAX-7，4℃中孵育过夜，吸去一抗PAX-7后用PBST洗三遍，加入荧光二抗，避光孵育一小时后再本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.诱导骨骼肌卫星细胞生成脂滴的方法，其特征在于，包括以下步骤：从刚出生1-5d的仔猪背肌中采集骨骼肌卫星细胞，并纯化，纯化后的骨骼肌卫星细胞待贴壁汇合到60％-70％时，进行生脂诱导。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述纯化采用差速贴壁方法。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述生脂诱导包括以下步骤：第1-2d，向基础培养基中添加地塞米松、胰岛素、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤和双抗，培养2d；第3-4d，向基础培养基中添加胰岛素、罗格列酮和双抗，培养2d；第5-6d，向基础培养基中添加地塞米松、胰岛素、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤和双抗，培养2d；第7-8d，向基础培养基中添加胰岛素、罗格列酮和双抗，培养2d；第9-10d，基础培养基中添加葡萄糖和双抗，培养2d。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述基础培养基采用DMEM/F12培养基。5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，第1-2d，向基础培养基中添加0.5-1μmol/L地塞米松、5-10μg/mL胰...

【专利技术属性】
技术研发人员：邱小宇，齐仁立，黄金秀，杨飞云，王琪，王敬，
申请(专利权)人：重庆市畜牧科学院，
类型：发明
国别省市：