一种体外构建瘢痕疙瘩模型的方法技术

本发明专利技术涉及一种体外构建瘢痕疙瘩模型的方法。该方法包括：将胶原冻干材料分别放入含有小室的多孔板的单孔里，将正常成纤维细胞悬液滴到胶原冻干材料上，孵育，多孔板的上室种植瘢痕疙瘩成纤维细胞，加入培养液培养，使得正常成纤维细胞向瘢痕疙瘩成纤维细胞转化。该方法构建简单，成本低，材料来源容易，构建得到的瘢痕疙瘩模型良好，对临床研究工作具有重要意义。意义。意义。

【技术实现步骤摘要】
一种体外构建瘢痕疙瘩模型的方法


[0001]本专利技术属于细胞生物学的
，特别涉及一种体外构建瘢痕疙瘩模型的方法。

技术介绍

[0002]瘢痕疙瘩是皮肤自发地或者是创伤愈合过程失调后产生的病理性瘢痕。它们的特征是成纤维细胞的异常增殖和胶原过度沉积。临床上表现为超过原伤口界限的、持续的、渐进性的向周围正常皮肤组织呈侵袭样生长，不断破坏周围正常的皮肤附属器。临床统计学数据发现，其好发于胸骨前、肩背部、双下颌部等张力较大的部位，同时耳垂部瘢痕疙瘩也较为常见，而且瘢痕疙瘩的发生也以黄色人种和黑色人种多见。由于缺乏研究瘢痕疙瘩的良好的模型，所以瘢痕疙瘩形成和发展机制的研究也受到一定程度的限制，进而导致临床上缺乏有效地的治疗手段和方法。

技术实现思路

[0003]本专利技术所要解决的技术问题是提供一种体外构建瘢痕疙瘩模型的方法，以填补现有技术的空白。
[0004]本专利技术提供一种体外构建瘢痕疙瘩模型的方法，包括：
[0005]将胶原冻干材料分别放入含有小室的多孔板的单孔里，将正常成纤维细胞悬液滴到胶原冻干材料上，孵育，多孔板的上室种植瘢痕疙瘩成纤维细胞，加入培养液培养，使得正常成纤维细胞向瘢痕疙瘩成纤维细胞转化，得到瘢痕疙瘩模型。
[0006]优选地，所述多孔板为六孔板。
[0007]优选地，所述正常成纤维细胞悬液是将正常成纤维细胞先消化离心，按照0.5
×
106‑1×
106个/ml重悬获得。
[0008]优选地，所述正常成纤维细胞悬液滴加量为0.2
‑
0.4微升/mm3。
[0009]优选地，所述正常成纤维细胞按照(2
‑
4)
×
102个/mm3滴到胶原冻干材料。
[0010]优选地，所述将正常成纤维细胞悬液滴到胶原冻干材料后滴加培养液，让材料保持湿润。
[0011]优选地，所述孵育时间为3
‑
4h。
[0012]优选地，所述瘢痕疙瘩成纤维细胞按照0.5
×
105‑1×
105种植到多孔板中的上室内。
[0013]优选地，所述多孔板的上室和下室之间可透膜的孔径大小要求上层细胞不能穿过。
[0014]优选地，所述培养液为含10％FBS、10万U/L青霉素、0.1g/L链霉素的DMEM培养液。
[0015]优选地，所述培养时间根据材料大小确定。
[0016]优选地，所述培养后的材料胶原冻干材料更换至空白多孔板中继续培养。
[0017]本专利技术通过将瘢痕疙瘩成纤维细胞与正常皮肤成纤维细胞共培养之后，正常皮肤
成纤维细胞开始具有瘢痕疙瘩成纤维细胞的特性，即正常皮肤成纤维细胞开始向瘢痕疙瘩成纤维细胞转化。本专利技术在体外通过三维共培养的方式构建瘢痕疙瘩，这对基础和临床研究工作具有重大的意义。
[0018]目前还没有一种简单方便的可用于基础研究的瘢痕疙瘩模型，现有的最常用的是直接利用瘢痕疙瘩组织块进行研究，但是由于瘢痕疙瘩的个体差异性和复杂性，所使用的瘢痕疙瘩组织块中所含瘢痕疙瘩成纤维细胞的数量有限，培养时间较久，不仅重复性差，且不利于储存和再利用。而本专利技术通过构建取得的瘢痕疙瘩模型，一是填补了瘢痕疙瘩模型的空缺，二是可重复性增强，这为技术人员对瘢痕疙瘩的基础研究提供了强有力的基础。
[0019]有益效果
[0020]本专利技术体外瘢痕疙瘩模型构建简单，重复性强，方便制作、储存和运输，成本低，材料来源容易，构建得到的瘢痕疙瘩模型良好，对临床研究工作具有重要意义。
附图说明
[0021]图1为本专利技术体外构建瘢痕疙瘩模型的共培养体系示意图，其中A为六孔板小室示意图，B为单孔示意图，1为transwell小室，2为上室，3为下室，4为单细胞层，5为可透膜，灰色代表培养基。
[0022]图2为本专利技术的瘢痕疙瘩成纤维细胞诱导正常成纤维细胞向其转化的基因检测图。分别检测了胶原1(COL1)、胶原3(COL3)、基质金属蛋白酶2(MMP2)、转录生长因子β1(TGF
‑
β1)、转录生长因子β3(TGF
‑
β3)、基质金属蛋白酶13(MMP13)、组织金属蛋白酶抑制剂1(TIMP1)、白介素
‑
6(IL
‑
6)和血管内皮生长因子(VEGF)。
[0023]图3为本专利技术空白对照组(CTRL)、阴性对照组(UP
‑
NF)、实验组(UP
‑
KF)划痕处理48小时后，在同一观察点处显微镜拍照记录细胞生长情况图。
[0024]图4为本专利技术空白对照组(CTRL)、阴性对照组(UP
‑
NF)、实验组(UP
‑
KF)细胞凋亡率图，其中A为流式检测图，B为流式检测结果统计图。
[0025]图5为本专利技术对照组(UP
‑
NF)和实验组(UP
‑
KF)的HE染色图。
具体实施方式
[0026]下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。此外应理解，在阅读了本专利技术讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本专利技术作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
[0027]本专利技术对于试剂其实没有特别的要求，常规使用的都可以。本专利技术实施例所使用的是：
[0028]高糖DMEM培养基
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Gibco,Gland Island,NY,美国
[0029]胎牛血清(FBS)
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Hyclone,美国
[0030]青、链霉素溶液
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Gibco,Gland Island,NY,美国
[0031]本专利技术实施例将瘢痕疙瘩成纤维细胞记为KF，正常成纤维细胞细胞记为NF。
[0032]实施例1
[0033]1、瘢痕疙瘩和正常皮肤组织的来源：
[0034]本实施例所使用的瘢痕疙瘩和正常皮肤组织源于手术切除，瘢痕疙瘩患者的年龄均在25到60岁之间，正常皮肤组织来源于儿童包皮环切术后。
[0035]2、成纤维细胞的获取：
[0036]将获得的瘢痕疙瘩标本用氯霉素冲洗3遍，然后用PBS缓冲液振荡洗涤3遍，以去除血渍及其他组织碎片；无菌条件下用刀片切去表皮，用手术剪去除皮下脂肪组织；正常皮肤组织使用中性蛋白酶浸泡过夜，去掉表皮，保留真皮组织。将得到的各组真皮部分剪至1
×
1mm2大小，PBS振荡洗涤1遍后加入0.2％的I型胶原酶，37℃恒温振荡消化，2～4h后收获真皮层细胞。消化产物以200目尼龙筛过滤后，细胞悬液1500rpm离心5min，弃上清。加入PBS振荡混匀，1500rpm离心5min，弃上清；取少量细胞，加入台盼兰(Trypan Blue)溶液进行拒染试验，用血球记数板进行活细本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种体外构建瘢痕疙瘩模型的方法，包括：将胶原冻干材料分别放入含有小室的多孔板的单孔里，将正常成纤维细胞细胞悬液滴到胶原冻干材料上，孵育，多孔板的上室种植瘢痕疙瘩成纤维细胞，加入培养液培养，使得正常成纤维细胞向瘢痕疙瘩成纤维细胞转化，得到瘢痕疙瘩模型。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述正常成纤维细胞悬液是将正常成纤维细胞先消化离心，按照0.5
×
106‑1×
106个/ml重悬获得。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述正常成纤维细胞悬液滴加量为0.2
‑
0.4微升/mm3。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述正常成纤维细胞按照(2
‑
4)
×
...

【专利技术属性】
技术研发人员：王秀侠，杨军，高振，
申请(专利权)人：上海交通大学医学院附属第九人民医院，
类型：发明
国别省市：