一种可原位激活内源性TGFβ1的可注射型骨修复材料的制备及其应用制造技术

一种可原位激活内源性TGFβ1的可注射型骨修复材料，所述修复材料由含水基质和微球两部分复合而成，所述微球是采用微流控法制备的粒径均一的TypeA明胶微球，所述含水基质由锂藻土(LaponiteXLG)及聚乙烯亚胺(PEI)改性的明胶分子分散到水相构成。采用扩散负载法将碱性的碳酸氢盐或者中性磷酸盐吸附到明胶微球内后，将其与含水基质混合可制备得到所述可注射型骨修复材料。射型骨修复材料。射型骨修复材料。

【技术实现步骤摘要】
一种可原位激活内源性TGF
β
1的可注射型骨修复材料的制备及其应用


[0001]本专利技术涉及生物医药材料领域，具体为一种可原位激活内源性TGFβ1的可注射型骨修复材料的制备及其应用。

技术介绍

[0002]口腔颌面部再生医学的一个长期目标是治疗由于外伤、肿瘤切除、牙周疾病、牙槽嵴吸收、治疗相关的颌骨骨坏死以及先天畸形所引起的口腔颌面部骨组织缺损、功能丧失和美学畸形。当损伤超过临界骨缺损大小时，骨组织无法自发愈合。目前，自体骨移植仍然是骨缺损修复的“金标准”。但是，取骨手术伴随的疼痛、感染、神经损伤以及功能缺失等风险限制了其应用。同种异体骨或者异种异体骨移植又常伴随免疫排斥或者疾病传播等问题。因此，应用组织工程的方法重建骨缺损部位的研究得到了极大关注。据报道，自1999年到2016年，全世界以组织工程为主题的科研论著共发表41588篇。预计到2023年，论著总数将会翻倍；而到2027年，论著总数更将达到现在的三倍。这进一步说明组织工程科学领域具有强大的生命力和巨大潜力。
[0003]细胞移植(cell transplantation)和细胞归巢(cell homing)，这两种促进组织缺损修复的方式在组织工程研究中都在被广泛应用。前者需要先从患者活体中获取干细胞样本；在体外扩增后，单独或者与支架材料一同注射到缺损部位，期望实现促进组织生长的目的。而后者是指在生物信号诱导下，干细胞或祖细胞向缺损部位迁移和移动，从而实现组织再生。细胞移植的主要科学价值在于可以体外对细胞进行基因修饰以及荧光标记，方便进一步研究这些细胞是否参与组织再生；方便通过连续移植的手段研究这些细胞是否保持干性；以及方便研究损伤处的病理环境对于移植细胞的影响。但是细胞移植过程中，获取/分离活细胞难度大，获取的细胞类型不确定，细胞维持和临床操作过程复杂且花费高，注射的细胞易死亡及流失，离体细胞易产生免疫排斥、病原体传播和致癌性等诸多问题限制了其临床应用。仅利用生物信号(如生长因子)的趋化作用(chemotaxis)诱导间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)从缺损边缘的细胞外基质(extracellular matrix，ECM)或血液中向缺损处归巢，从而促进组织再生的方法可以很好地避免上述细胞移植带来的问题，同时也是现今组织工程研究的前沿热点，它很有希望未来在临床广泛应用。
[0004]在骨缺损处通过生物材料或其他载体释放相关的生长因子可以达到诱导骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell,BMSC)归巢并促进骨再生的目的。Yoon et al.报道了在壳聚糖水凝胶中加入外源性转移生长因子β1(transforming growth factorβ1,TGFβ1)和骨形成蛋白
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2(bone morphogenetic protein
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2，BMP
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2)后，可以促进兔胫骨缺损修复。但是驱使外源性生长因子在骨缺损处释放的方案存在很多缺点，如支架材料中的生长因子易降解，生物活性不确定和成本高等。因此，很多学者将关注点放在了不直接添加生长因子而诱导BMSC归巢的研究。Zhang et al.直接将含有血小板衍生生长因子b(platelet
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derived growth factor b，PDGF
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b)以及BMP
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7序列的腺病毒载体与支架材料
一同注射到小猎犬牙周缺损处后，被转染的细胞可以持续产生相应的生长因子，从而促进了牙周缺损的修复。这种方法虽然节省了成本并避免了蛋白质不稳定的问题，却增加了病毒感染以及免疫排斥的可能性。相比之下，利用内源性生长因子诱导BMSC归巢并成骨的方案将会是更具吸引力以及安全可靠的选择。
[0005]在哺乳动物体内，内源性TGFβ1广泛存在于器官、组织基质以及很多细胞中。其中，骨基质和血小板内的TGFβ1含量最高。TGFβ1在器官发育、损伤修复、肿瘤抑制以及动脉粥样硬化等方面发挥着重要作用。在骨修复方面，TGFβ1主要通过SMAD信号通路诱导BMSC归巢；它还能提高骨祖细胞增殖以及在高浓度时促进软骨细胞分化(抑制成骨细胞分化)。与其他生长因子不同，基质中的以及细胞刚分泌的TGFβ1都是以潜伏(latent)TGFβ1(LTGFβ1)复合物的形式存在，不能与其受体相结合。只有通过一定方法破坏TGFβ1蛋白二聚体与潜伏相关前肽(latency
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associated propeptide,LAP)之间的非共价键(静电相互作用)后，才能获得激活的TGFβ1(activated TGFβ1，aTGFβ1)。因此，如何安全有效的激活骨缺损处的内源性LTGFβ1是骨组织工程研究中急需解决的热点问题。
[0006]LTGFβ1可以在多种理化条件下被激活。通过高温加热(75℃
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100℃)或超声震荡、外加整合素结合以及外加蛋白酶催化(如基质金属蛋白酶和血纤维蛋白溶酶)等方法都可以在体外很好的激活LTGFβ1。但是在缺损处加热和超声处理很可能带来二次损伤；生物材料中添加大分子蛋白既不易保存又可能引起免疫反应，因此这些方法都不适合应用于内源性LTGFβ1的激活。目前为止，只有非常有限的文献报道了如何通过激活内源性LTGFβ1，促进组织再生的研究。Mooney的研究团队应用低能量激光照射牙髓残余组织后，产生的氧自由基激活了从牙本质小管中释放的内源性LTGFβ1。这些aTGFβ1诱导了成人牙源性干细胞(dental stem cell，DSC)从根尖孔向根管内迁移，并实现了牙髓再生。但是由于骨缺损范围通常较大且常伴有出血，而低能量激光只能在很小范围内产生作用，且其在血液中的穿透力有限，因此并不适合在骨组织工程的研究中应用。
[0007]细胞外pH值的变化可以起到多种调节作用。非生理酸性(pH1
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6)以及碱性(pH8
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14)环境可以破坏LAP与TGFβ1蛋白二聚体之间的静电相互作用，从而解离获得aTGFβ1。在体外用浓盐酸处理猪皮质骨后，其酸溶解物中被证明含有aTGFβ1。在培养基中加入此酸溶解物后，可以检测到成纤维细胞内的TGFβ1相关目标基因表达。另外，血清中的LTGFβ1在理论上也可以在非生理性pH条件下被激活。血清中的LTGFβ1，是在血凝块形成过程中，由聚集的血小板释放出来的。另外，非生理性pH环境也会很明显的影响骨修复的过程。偏碱性pH环境更利于增强BMSC碱性磷酸酶活性，和促进成骨细胞增殖、分化以及矿化的能力；而偏酸性pH环境会降低成骨细胞中碱性磷酸酶活性以及激活破骨细胞活性，从而增强骨吸收作用。因此，在骨缺损处创造最佳的碱性非生理性pH的环境以及选择合适的作用时间，很可能安全有效的激活骨基质和血清中的LTGFβ1，从而诱导BMSC归巢并促进骨再生。

技术实现思路

[0008]本专利技术的目的在于提供一种可原位激活内源性TGFβ1的可注射型骨修复材本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种可原位激活内源性TGFβ1的可注射型骨修复材料，其特征在于，所述修复材料由含水基质和微球两部分组成，所述微球是采用微流控法制备的粒径均一的TypeA明胶微球，所述含水基质由锂藻土及聚乙烯亚胺(PEI)改性的明胶分子分散到水相构成，采用扩散负载法将碱性的碳酸氢盐或者中性磷酸盐吸附到明胶微球内后，将其与含水基质混合可制备得到所述可注射型骨修复材料。2.根据权利要求1所述的可注射型骨修复材料，其特征在于，所述Type A明胶微球采用微流控的方式制备，明胶微球直径在120μm左右，所述含水基质部分由4.5wt％的锂藻土凝胶及2wt％的PEI改性的明胶溶液构成。3.根据权利要求2所述的可注射型骨修复材料，其特征在于，含水基质的制备方法为：在水中溶解PEI改性的明胶，将锂藻土在水中震荡分散30s，之后将它们混合均匀，得到含水基质，其中锂藻土水凝胶终浓度为4.5wt％，PEI改性的明胶浓度为2wt％。4.根据权利要求1所述的可注射型骨修复材料，其特征在于，所述PEI改性的明胶分子是将PEI分子通过碳化二亚胺催化氨基
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羧基的缩合反应与Type A明胶分子接枝到一起，透析并冻干后获得干燥样品。5.根据权利要求1所述的可注射型骨修复材料，其特征在于，所述碱性的碳酸氢盐的水溶液pH值为10，所述中性磷酸盐...

【专利技术属性】
技术研发人员：周永胜，牛宇霆，杨振，杨洋，
申请(专利权)人：北京大学口腔医学院，
类型：发明
国别省市：