一种预测肿瘤细胞化疗耐药性的标志物及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种预测肿瘤细胞化疗耐药性的标志物及其应用。具体方法为作为标志物的所述SirT7

【技术实现步骤摘要】
一种预测肿瘤细胞化疗耐药性的标志物及其应用


[0001]本专利技术属于肿瘤细胞耐药性检测
，尤其涉及一种预测肿瘤细胞化疗耐药性的标志物及其应用。

技术介绍

[0002]化疗在肿瘤的治疗中占有重要地位，但肿瘤细胞极易对化疗药物产生耐药性，一旦癌细胞产生耐药性，化疗药物就无法杀伤癌细胞，但却对正常细胞造成杀伤，引起越来越大的副作用，导致治疗失败，肿瘤细胞耐药性成为治疗肿瘤的最大障碍之一。肿瘤化疗采用最多的药物是DNA损伤药物，而DNA损伤药物对DNA造成的损伤可以通过细胞中不同的DNA修复机制得到修复，这也是细胞对DNA损伤药物产生耐药性的主要原因。然而，患者对化疗药物的耐受性是有个体差异的，如何预测药物的耐药性及敏感性是如何选择用药的关键。对于药物敏感性以及耐药性的许多潜在生物标记物研究已经有一些，但仅有极少数有潜在临床应用的可能，并且相对于分子靶向治疗及免疫检测点治疗的靶向指示性，DNA损伤药物缺乏相应的生物标记物来靶向指导药物的选择，因此，在个体化治疗以及精准医学背景下，开发研究更多的肿瘤耐药的检测指标，这也将是实施肿瘤预见、预后、个体化化疗的前提。
[0003]蛋白磷酸化修饰在肿瘤化疗耐药性中发挥重要的作用，蛋白磷酸化是将外界刺激转化为细胞内信号的一个主要机制，是一种广泛的翻译后修饰，同时也是原核和真核生物中最重要的调控形式。由于蛋白质氨基酸侧链加入了一个带有强负电的硝酸基团，发生酯化作用，从而改变了蛋白质的构型、活性及与其他分子相互作用的能力，在多种生物学过程，如信号传导、基因表达、细胞分裂等的调控中起重要作用，异常的蛋白质磷酸化通常与癌症有关。人类蛋白质组中含有十万多个潜在的磷酸化位点，大多数磷酸化蛋白含有一个以上的磷酸化位点，并且以不同磷酸化形式的混合物存在，在细胞内活性调控中发挥重要的作用。在肺癌细胞中，p
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GSK
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3βser9升高是造成肺癌耐药性的原因之一，Cx43
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S368的磷酸化上调是造成卵巢癌化疗耐药的主要原因。因此，深入研究蛋白磷酸化修饰与肿瘤耐药的关系与调控机制，有利于开发肿瘤耐药预测指标及指导化疗用药。
[0004]组蛋白去乙酰化酶Sirtuin家族是调控肿瘤化疗耐药中非常关键的一类蛋白，它们是与酵母Sir2同源的相关酶类。Sirtuin家族由七个成员组成，SirT1
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7，它们都有一个保守的NAD依赖的催化核心区，促进NAD依赖的去乙酰化酶活性以及ADP核糖转移酶活性。Sirtuins依赖于其去乙酰化活性，参与调控细胞的代谢、衰老、增殖、抗压及炎症氧化应激反应等。Sirtuins具有复杂的促癌或抑癌作用，其中SirT7是Sirtuin家族中唯一定位在核仁的蛋白，大量的癌症研究将SirT7归为原癌基因，一方面SirT7通过去乙酰化H3K18维持癌症的特征，另外一方面SirT7促进rDNA转录这一功能也正好符合癌细胞快速增殖对核糖体生成的需要。SirT7自身并没有表现出原癌基因的特性，因为过表达SirT7并不能导致原生纤维母细胞发生癌变，因此认为在癌细胞中SirT7过量表达可能是为了满足快速增殖的癌细胞对核糖体生成的需求。最近报道SirT7通过去琥珀酰化H3K22促进染色体凝集以及参与双链DNA损伤(DSB)修复，这些研究揭示SirT7可能作为肿瘤研究的热点蛋白，但SirT7能否
作为肿瘤耐药检测或治疗的靶点，目前的研究还不够，还需要解决的问题是SirT7如何参与化疗药物胁迫以及SirT7的上下游调控如何。据报道，SirT7的磷酸化修饰介导SirT7的定位改变，对其功能影响至关重要。因此，研究SirT7的磷酸化修饰与肿瘤耐药的关系与调控将变得极为有意义，有利于寻找肿瘤化疗药物耐药性预测标志物，可实际用于临床肿瘤预测预后与指导化疗用药。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于解决SirT7如何参与化疗药物胁迫以及SirT7的上下游调控如何的问题，提供一种基于SirT7
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S288的预测肿瘤细胞化疗耐药性的高灵敏度、高特异性、可实际应用于肿瘤化疗耐药性预测的生物标志物、其制备方法。为了实现上述目的，本专利技术是通过以下方案予以实现的：
[0006]作为本专利技术的第一个方面，在于提供一种预测肿瘤细胞化疗耐药性的标志物，所述标志物为组蛋白去乙酰化酶SirT7
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S288位点磷酸化。
[0007]作为标志物的所述SirT7
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S288位点的磷酸化形式是在前期根据化疗药物胁迫结合磷酸化质谱鉴定筛选出来的在化疗药物处理后，SirT7
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S288位点磷酸化增强，通过制备针对SirT7
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S288位点特异的磷酸化抗体用以检测SirT7位点的磷酸化，作为肿瘤耐药的检测指标。
[0008]作为本专利技术的第二个方面，在于提供所述标志物的应用，通过制备针对SirT7
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S288位点磷酸化的特异性抗体，标记所述标志物；
[0009]具体地，所述抗体制备方法包括如下步骤：
[0010]步骤一：以SirT7
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S288位点为中心两侧各毗邻4个氨基酸设计为一段14个氨基酸的SirT7
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S288合成肽；
[0011]步骤二：合成含SirT7
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S288磷酸化位点的抗原合成肽；
[0012]步骤三：全抗原免疫兔子及收集抗血清：将步骤二中SirT7
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S288抗原合成肽与佐剂联合免疫SFP级新西兰大白兔，采用背部皮肤注射，多点注射抗原乳状液；免疫次数包括3次注射和最后一次加强注射，产生SirT7
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S288特异性磷酸化抗体，以ELISA测定抗血清针对目的合成肽的效价；
[0013]步骤四：纯化并鉴定SirT7
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S288特异性磷酸化抗体，即p
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SirT7
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S288磷酸化抗体：采用合成肽偶联琼脂糖层析柱的亲和层析法进行抗体亲和分离
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亲和纯化方法，先过一次非磷酸化合成肽偶联的层析柱去除抗血清中的非磷酸化抗体，得到含磷酸化抗体的血清；然后将上述血清过一次磷酸化合成肽偶联的层析柱，最后洗脱得到磷酸化抗体的血清，最后通过Western blot实验鉴定抗体的效价；
[0014]步骤五：采用SirT7
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S288特异性磷酸化抗体检测SirT7
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S288磷酸化，作为肿瘤耐药的检测指标。
[0015]进一步的，步骤一中所述合成肽的其氨基酸序列为CMTKPPSRRPKLYI，如序列表SEQ ID NO：1所示。
[0016]进一步的，所述标志物的应用，在于肿瘤耐化疗药物检测以及耐辐射等相关肿瘤治疗预测。
[0017]更进一步的，作为本专利技术的第三个方面，作为所述标志物的一种应用方式，还在于
制备肿瘤耐药或耐辐射相关的ELISA检测试剂盒，所述试剂盒包括所述S本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种预测肿瘤细胞化疗耐药性的标志物，其特征在于，所述标志物为组蛋白去乙酰化酶SirT7
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S288位点磷酸化。2.根据权利要求1提供的一种预测肿瘤细胞化疗耐药性的标志物的应用，其特征在于，通过制备针对SirT7
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S288位点磷酸化的特异性抗体，标记所述标志物。3.根据权利要求2所述的一种预测肿瘤细胞化疗耐药性的标志物的应用，其特征在于，所述抗体制备方法包括如下步骤：步骤一：以SirT7
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S288位点为中心两侧各毗邻4个氨基酸设计为一段14个氨基酸的SirT7
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S288合成肽；步骤二：合成含SirT7
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S288磷酸化位点的抗原合成肽；步骤三：全抗原免疫兔子及收集抗血清：将步骤二中SirT7
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S288抗原合成肽与佐剂联合免疫SFP级新西兰大白兔，采用背部皮肤注射，多点注射抗原乳状液；免疫次数包括3次注射和最后一次加强注射，产生SirT7
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S288特异性磷酸化抗体，以ELISA测定抗血清针对目的合成肽的效价；步骤四：纯化并鉴定SirT7
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S288特异性磷酸化抗体：采用合成肽偶联琼脂糖层析柱的亲和层析法进行抗体亲和分离
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亲和纯化方法，先过一次非磷酸化合成肽偶联的层析柱去除抗血清中的非磷酸化抗体，得到含磷酸化抗体的血清；然后将上述血清过一次磷酸化合成肽偶联的层析柱，最后洗脱得到磷酸化抗体的血清，最后通过Western blot实验鉴定抗体的效价。4.根据权利要求3所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：王传贵，孙莲慧，唐玉敏，孟玲，范广建，胡晨，潘波，张森，
申请(专利权)人：泰山科学技术研究院山东第一医科大学第二附属医院，
类型：发明
国别省市：