一种高灵敏免标记的肾癌血清检测生物试剂制造技术

本发明专利技术公开了一种高灵敏免标记的肾癌血清检测生物试剂，包括11

【技术实现步骤摘要】
一种高灵敏免标记的肾癌血清检测生物试剂


[0001]本专利技术涉及生物医学检测、体外诊断
，具体为一种高灵敏免标记的肾癌血清检测生物试剂。

技术介绍

[0002]外泌体是一类特殊的细胞外囊泡(EVs)，大多数细胞分泌的外泌体直径为30
‑
150nm。它们能够充当细胞间通讯的介质。EVs携带几种代表它们细胞起源的膜结合分子和囊内分子。四次跨膜蛋白家族，例如CD63、CD9和CD81，主要用作外泌体标记。肿瘤衍生的EV(T
‑
EV)还表达了多种肿瘤表面标志物，例如上皮细胞粘附分子(Epcam)、表皮生长因子受体(EGFR)和CA125。近年来，利用这些生物标志物追踪体液中的EV/T
‑
EV成为一种非侵入性的癌症液体活检方法，尽管这种潜在的应用前景广阔，但在临床样品中鉴定和定量EV仍然具有挑战性。目前，提纯EVs最常用的方法涉及一系列高速超速离心步骤，这非常耗时，不适用于大量临床样品。
[0003]最近的研究结果表明，癌细胞产生的EVs明显多于健康细胞，这些与癌症相关的EVs是用于早期癌症检测和治疗监测的良好的生物标志物。然而，由于其体积小、体液中存在其他成分的复杂背景等，目前尚无临床批准的EV检测准确检测试剂。

技术实现思路

[0004]本专利技术提供了如下的技术方案：一种高灵敏免标记的肾癌血清检测生物试剂，实现等离激元超表面在血清外泌体检测中的应用。
[0005]一种高灵敏免标记的肾癌血清检测生物试剂，其特征在于，包括11/>‑
巯基十一烷酸溶液(MUA)、磷酸盐缓冲液(PBS)、乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺(EDC)、N
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羟基琥珀酰亚胺(NHS)、牛血清白蛋白(BSA)、抗糖类抗原9(anti
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CD9)。
[0006]一种高灵敏免标记的肾癌血清检测生物试剂的制作方法，其包括如下步骤：
[0007]步骤一：活化等离激元超表面结构：将11
‑
巯基十一烷酸溶液(MUA)加入乙醇溶液，配制得12mmol/L的MUA乙醇溶液，将所述超表面结构放在MUA乙醇溶液中保存4至8小时，形成MUA自组装膜；
[0008]步骤二：活化MUA：配制400mmol/L的丙基碳化二亚胺(EDC)溶液和100mmol/L的N
‑
羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶液，先用去离子水清洗所述步骤一中的等离激元超表面结构，然后用所述400mmol/L的丙基碳化二亚胺(EDC)溶液和100mmol/L的N
‑
羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶液将超表面结构浸泡0.5至1.0个小时，活化MUA；
[0009]步骤三：偶联抗体：将所述步骤二中的等离激元超表面结构放在40ug/mL的抗糖类抗原9(anti
‑
CD9)溶液中浸泡0.5至1.0个小时，使所述抗糖类抗原9(anti
‑
CD9)溶液中的anti
‑
CD9与所述等离激元超表面结构已活化的MUA结合；
[0010]步骤四：封闭未连接抗体的MUA：在所述步骤三中的等离激元超表面结构中加入浓度为1％至3％BSA溶液，封闭未连接抗糖类抗原9(anti
‑
CD9)的MUA。
[0011]本专利技术的有益效果是：采用等离激元超表面结构进行外泌体无损传感检测，可实现低至300个/mL外泌体溶液的高灵敏检测，准确性高且操作简单，对患者与健康两组的实验比较采用双样本t检验，P<0.001。
附图说明
[0012]附图用来提供对本专利技术的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本专利技术的实施例一起用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的限制。在附图中：
[0013]图1为本专利技术的等离激元超表面结构用于肾癌外泌体检测原理示意图；
[0014]图2为本专利技术的肾癌外泌体SEM表征图；
[0015]图3为本专利技术的肾癌外泌体粒径分布图；
[0016]图4为本专利技术的不同浓度的肾癌外泌体检测实验结果图；
[0017]图5为本专利技术的试剂盒提取与血清外泌体检测实验结果对比图；
[0018]图6为本专利技术的临床血清样本检测结果图。
[0019]图中：等离激元超表面结构1，11
‑
巯基十一烷酸溶液(MUA)2，外泌体捕获抗体3，外泌体4。
具体实施方式
[0020]为使本专利技术实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本专利技术。
[0021]如图1
‑
6所示，本专利技术一种高灵敏免标记的肾癌血清检测生物试剂，实现了等离激元超表面结构在肾癌血清外泌体免标记检测中的应用。
[0022]请参阅图1，本专利技术包括：等离激元超表面结构1，11
‑
巯基十一烷酸溶液(MUA)2，外泌体捕获抗体3，外泌体4。
[0023]所述外泌体捕获抗体3包括：抗糖类抗原9(anti
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CD9)、抗糖类抗原63(anti
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CD63)、抗糖类抗原81(anti
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CD81)、抗上皮细胞粘附分子(anti
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Epcam)、表皮生长因子受体(anti
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EGFR)和抗糖类抗原125(anti
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CA125)。
[0024]所述外泌体4可以由上述捕获抗体中的一种或几种组合使用来实现检测。
[0025]具体实施例一
[0026]请参阅图3,具体为本专利技术基于等离激元表面对不同浓度的肾癌外泌体检测实验结果图，其实验步骤具体说明如下，
[0027]步骤一：活化等离激元超表面结构1：配制12mmol/L的MUA乙醇溶液，将所述超表面结构放在MUA乙醇溶液中保存4至8小时，形成MUA自组装膜；
[0028]步骤二：活化MUA：配制400mmol/L的EDC溶液和100mmol/L的NHS溶液，先用去离子水清洗所述步骤一中的等离激元超表面结构1，然后用所述400mmol/L的EDC溶液和100mmol/L的NHS溶液将超表面结构浸泡0.5至1.0个小时，活化MUA；
[0029]步骤三：偶联抗体：将所述步骤二中的等离激元超表面结构1放在40ug/mL的anti
‑
CD63溶液中浸泡0.5至1.0个小时，使所述anti
‑
CD63溶液中的anti
‑
CD63与所述等离激元超表面结构1已活化的MUA结合；
[0030]步骤四：封闭未连接抗体的MUA：在所述步骤三中的等离激元超表面结构1中加入
浓度为1％至3％BSA溶液，封闭未连接anti
‑
CD63的MUA；
[0031]检测外泌体4：加入浓度范围为3
×
102‑3×
10
11
个/mL待测溶液进行测定。共振本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高灵敏免标记的肾癌血清检测生物试剂，其特征在于，包括11
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巯基十一烷酸溶液(MUA)、磷酸盐缓冲液(PBS)、乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺(EDC)、N
‑
羟基琥珀酰亚胺(NHS)、牛血清白蛋白(BSA)、抗糖类抗原9(anti
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CD9)。2.一种高灵敏免标记的肾癌血清检测生物试剂的制作方法，其特征在于，其包括如下步骤：步骤一：活化等离激元超表面结构：将11
‑
巯基十一烷酸溶液(MUA)加入乙醇溶液，配制得12mmol/L的MUA乙醇溶液，将所述超表面结构放在MUA乙醇溶液中保存4至8小时，形成MUA自组装膜；步骤二：活化MUA：配制400mmol/L的丙基碳化二亚胺(EDC)溶液和100mmol/L的N
‑
羟基琥珀酰亚胺(...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱锦锋，申家情，王振标，李法君，
申请(专利权)人：厦门大学，
类型：发明
国别省市：