一种用于筛选西妥昔单抗原发耐药生物标志物的方法、用该方法筛选的生物标志物及其用途技术

本申请涉及一种用于筛选头颈鳞癌西妥昔单抗原发耐药生物标志物的方法、用该方法筛选的生物标志物及其用途。本申请通过建立头颈鳞癌患者肿瘤组织来源的小鼠异种移植瘤模型(patient

【技术实现步骤摘要】
一种用于筛选西妥昔单抗原发耐药生物标志物的方法、用该方法筛选的生物标志物及其用途


[0001]本申请属于生物医药领域，具体涉及一种用于筛选头颈鳞癌西妥昔单抗原发耐药生物标志物的方法、用该方法筛选的生物标志物及其用途。

技术介绍

[0002]头颈癌是中国乃至全球癌症谱高发恶性肿瘤，是影响人们生命健康和生活质量最严重的癌症之一。根据全球癌症统计，全球每年约有超过55万例新生的头颈癌，其全球发病率居全身肿瘤第三位，致死率占第六位。在头颈癌中，90％以上为头颈部鳞状细胞癌，简称头颈鳞癌。头颈部解剖复杂，各类器官密集，且多为重要器官。因此头颈鳞癌的发生不仅对患者外貌和基本生理功能(咀嚼、吞咽、呼吸等)、感觉功能(味觉、嗅觉、听觉)和语言功能产生极大破坏，并严重影响患者的生活质量。因此，如何在多器官密集的头颈部杀伤肿瘤细胞的同时保护器官的基本生理功能，并最大程度的维持患者生活质量是临床医生和科研工作者共同面对的巨大难题。
[0003]头颈鳞癌原发部位众多，病理类型多样，其复杂程度居全身肿瘤之首，正严重威胁人们的生命健康。虽然近年来医疗器械和治疗技术突飞猛进，但在中国头颈鳞癌患者的五年生存率仍未明显改善。目前手术治疗仍是头颈鳞癌的唯一根治性治疗策略，且为了尽可能全面切除肿瘤细胞，需进行扩大切除，但鉴于头颈的特殊解剖部位，肿瘤根治切除严重影响患者生活质量，造成沉重的家庭社会负担。此外，头颈鳞癌的常规治疗方案以放化疗为主，然而多项临床研究显示只有一小部分患者能够从放化疗中获益，超过65％的头颈鳞癌患者会出现复发和/或转移，大多数复发和/或转移的头颈鳞癌患者的存活率低于一年。
[0004]表皮生长因子受体EGFR在超过90％的头颈鳞癌患者中存在着高表达，抑制EGFR是头颈鳞癌唯一的靶向治疗策略。西妥昔单抗是一种阻断EGFR的嵌合体IgG1的单克隆抗体，作为NCCN临床指南建议用于头颈鳞癌一线治疗的唯一靶向药物，与放疗联合治疗局部晚期头颈鳞癌，或与铂类化疗联合治疗复发和/或转移性头颈鳞癌。西妥昔单抗的作用机制涉及与内源性EGFR配体竞争结合到易接近的细胞外结构域，随后阻断受体依赖的信号转导通路，进而发挥抑制肿瘤细胞生长、抑制血管生成、抑制肿瘤转移等作用。
[0005]尽管西妥昔单抗联合治疗改善了头颈鳞癌的临床预后，但原发耐药及用药过程中产生的继发耐药增加了肿瘤复发率并限制了西妥昔单抗临床疗效。值得注意的是，西妥昔单抗在头颈鳞癌治疗中的治疗疗效较低，单药治疗组的客观缓解率为13％，联合化疗组为36％。尽管持续维持西妥昔单抗治疗，在使用EXTREME治疗方案的头颈鳞癌患者从初次使用直到治疗失败的时间也仅为5个月左右。更为重要的是，文献报道大约仅有10
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20％的晚期癌症患者在使用药物阻断EGFR通路后能实现肿瘤生长抑制，且大多数最初对西妥昔单抗有反应的患者最终也会表现出继发耐药。
[0006]对于靶向药物药效生物标记物的积极探寻一直是肿瘤研究的热点，更是实现癌症精准治疗的关键。近年来通过大规模人群队列及各种新型组学技术的研究，越来越多的研
究已证实：肿瘤异质性是肿瘤治疗过程中疗效出现明显差异和耐药性产生的主要原因。肿瘤异质性包括肿瘤间异质性和肿瘤内异质性，其中肿瘤间异质性主要表现为人群水平不同患者之间对药物的原发耐药性和敏感性。在此基础上，近年来，围绕西妥昔单抗的原发耐药已进行了大量研究；然而迄今为止，临床上西妥昔单抗的用药指征在包括头颈鳞癌在内的大多数肿瘤中却依然十分匮乏，仅在结直肠癌中明确了KRAS基因突变可以介导西妥昔单抗的原发耐药。
[0007]在结直肠癌中，一项来自7个欧洲国家的11个中心收集了自2001年至2008年间经西妥昔单抗联合化疗治疗的1022份肿瘤样本，并对KRAS、BRAF、NRAS和PIK3CA基因变异情况进行检测。结果显示，KRAS突变型患者相比于野生型患者对西妥昔单抗的有效率更低(6.7％vs 35.8％)，中位无进展生存期更短(12周vs 24周)。此外，多项结直肠癌中的前瞻性临床研究表明西妥昔单抗与放疗联合用药只能使KRAS野生型结直肠癌患者获益，而对于KRAS突变患者无明显临床疗效。因此KRAS基因状态检测有助于确定结直肠癌患者中西妥昔单抗的疗效，KRAS突变是第一个可以预测结直肠癌患者将对靶向治疗药物西妥昔单抗耐药的生物标记物，为个体化治疗方案的确定提供理论依据。2009年NCCN更新了结直肠癌指南建议KRAS野生型晚期转移性结直肠癌患者一线治疗选择西妥昔单抗联合化疗。
[0008]西妥昔单抗推荐适应症除转移性结直肠癌外，主要为一线治疗复发/转移性头颈部鳞状细胞癌。但是，相比于KRAS在结直肠癌中较高的突变频率(中国人群超过40％)，KRAS在头颈鳞癌中突变频率极低(中国人群低于2％)，因此KRAS突变在头颈鳞癌中无法作为原发耐药标志物。在头颈癌中，由于基础及临床研究的滞后，暂时无大规模队列研究聚焦西妥昔单抗的原发耐药性，揭示西妥昔单抗的药效生物标志物。2017年，Friederike等对2010年至2016年间59例接受姑息治疗的头颈鳞癌患者进行了筛查，发现西妥昔单抗耐药性与EGFR
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K521多态性相关。2020年，Nellie等通过体内外研究证实AXL酪氨酸残基Y821通过激活头颈鳞癌c
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ABL激酶介导西妥昔单抗的抗药性。2020年，法国居里研究所的研究者对2006年至2015年间使用西妥昔单抗治疗的118例头颈鳞癌患者的肿瘤标本进行PIK3CA和H/N/KRAS基因突变检测，以及PTEN和EGFR免疫组织化学分析。结果显示，西妥昔单抗联合化疗的治疗效果与头颈鳞癌患者PIK3CA和KRAS/HRAS基因突变无关，且表皮生长因子受体EGFR的高表达不能预测西妥昔单抗的敏感性。鉴于此，迄今为止，在头颈鳞癌中没有一个预测性生物标志物能够指导患者进行西妥昔单抗治疗。
[0009]在头颈鳞癌中，目前已开展的西妥昔单抗原发耐药生物标志物研究主要使用患者肿瘤组织进行回顾性研究。这种回顾性研究，主要聚焦几种在结直肠癌中已被证实和西妥昔单抗耐药性相关基因的分析，通过检测目标分子的突变或者表达水平，进而评估该分子是否能在头颈鳞癌中也能作为药效预测标志物。但是多年来的研究证实，这一方式在头颈鳞癌中难以发现西妥昔单抗原发耐药的生物标志物。一方面，由于不同肿瘤的发病机制及遗传背景差异，在结直肠癌中高频变异的基因很有可能在头颈鳞癌中无明显变异，在结直肠癌中显著高表达的基因很有可能在头颈鳞癌中无变化或不表达；另一方面，聚焦个别基因的变化，而忽视肿瘤整体水平的突变和基因表达，也会导致原发耐药预测标志物的筛选效率低，难以发现准确的药效标志物；此外，这些研究多使用临床样本进行回顾性分析，但是由于伦理限制，西妥昔单抗鲜少以单药对患者进行治疗，常联合多种化疗药物及放疗，且患者在西妥昔单抗治疗前有可能经历过多种其他药物治疗，基于这些肿瘤样本分析出来的
原发耐药标志物往往特异性和准确性不足，难以在临床实践中应用。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用患者肿瘤组织来源的异种移植瘤模型(PDX模型)临床替代性试验筛选头颈鳞癌西妥昔单抗原发耐药生物标志物的方法，所述方法包括以下步骤：(1)利用头颈鳞癌患者肿瘤组织在免疫缺陷鼠中构建头颈鳞癌PDX模型；(2)获取头颈鳞癌PDX模型对应患者的临床信息，包括既往病史、临床治疗情况、用药情况等；(3)头颈鳞癌PDX模型第一队列的构建：依托建立的头颈鳞癌PDX模型生物样本库，根据对应患者的临床信息，随机筛选若干例头颈鳞癌PDX模型入组，将每例活体保存的PDX移植瘤样本接种至裸鼠皮下，用于后续西妥昔单抗临床替代性试验；(4)开展西妥昔单抗PDX模型临床替代性试验：待头颈鳞癌PDX模型肿瘤体积达到一定值后，将每个PDX病例随机分为对照组和西妥昔单抗单药治疗组，开始药物治疗，PDX模型分别接受PBS或西妥昔单抗腹腔注射，每周对小鼠进行肿瘤体积和体重测量；(5)PDX模型临床替代性试验中西妥昔单抗药效评估：为了评估对西妥昔单抗的药物响应情况，通过PDX模型中移植瘤用药前后的体积变化来评估药物反应，具体标准如下：1)肿瘤完全消退(mCR)，肿瘤体积至少减少40％；2)肿瘤部分消退(mPR)，肿瘤体积减少20％～40％；3)疾病进展(mPD)，肿瘤体积至少增加30％；4)疾病稳定(mSD)，肿瘤体积变化在30％增长和20％减少之间；mPD模型被确定为原发耐药模型，mCR模型定义为敏感模型；(6)借助模型临床替代性试验筛选原发耐药候选药效标志物：对所述原发耐药模型及敏感模型分别进行全外显子组测序及转录组测序，根据原发耐药模型与敏感模型的差异基因变异谱和/或差异基因表达谱，结合基因功能与信号通路分析结果，初步筛选出原发耐药候选药效标志物；(7)开展独立PDX模型临床替代性试验：依托头颈鳞癌PDX模型生物样本库，根据对应患者的临床信息，再次随机筛选若干例头颈鳞癌PDX模型作为第二队列入组，所选第二队列与所述第一队列不重叠，以与步骤(4)中相同的方式，对入组PDX模型进行西妥昔单抗单药处理，用药若干周，例如3周后，进行移植瘤的样本采集与活体保存，通过评估西妥昔单抗药效，区分出原发耐药模型及敏感模型；(8)利用独立PDX模型临床替代性试验验证药效标志物：利用独立PDX模型临床替代性试验中的样本，采用实时荧光定量PCR(qRT
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PCR)方法，对候选变异基因和表达基因进行验证，筛选出基因变异或表达趋势在所述第一和第二队列中一致的基因，将所选的药效预测性生物标志物绘制受试者工作特征曲线(Receiver Operating Characteristic Curve，ROC)，采用SPSS 21.0统计学软件进行分析，并...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙树洋，张志愿，姚艳丽，杨桂柱，王玉珏，
申请(专利权)人：上海交通大学医学院附属第九人民医院，
类型：发明
国别省市：