一种鉴别非洲猪瘟Ⅰ型毒株与Ⅱ型毒株的双重荧光探针引物组合、试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种鉴别非洲猪瘟Ⅰ型毒株与Ⅱ型毒株的双重荧光探针引物组合、试剂盒及其应用，属于分子生物学技术领域。所述双重荧光探针引物组合包括用于检测非洲猪瘟病毒Ⅰ型毒株的引物探针组和用于检测非洲猪瘟病毒通用P72基因的引物探针组。本发明专利技术通过在非洲猪瘟病毒的保守区对基因组进行分析比对，最终筛选出基因B117L并选择Ⅰ型毒株与Ⅱ型毒株具有较大差异的片段，进行探针引物的设计和反应条件优化，使两种病毒基因扩增效率相近，并研制方便诊断的试剂盒，可以一次性检出是非洲猪瘟病毒Ⅰ型感染、Ⅱ型感染或两种病毒共同感染，具有灵敏性高、特异性强、重复性好的优点，为猪场非洲猪瘟防控提供技术支持。洲猪瘟防控提供技术支持。洲猪瘟防控提供技术支持。

【技术实现步骤摘要】
一种鉴别非洲猪瘟Ⅰ型毒株与Ⅱ型毒株的双重荧光探针引物组合、试剂盒及其应用


[0001]本专利技术属于分子生物学
，具体涉及一种鉴别非洲猪瘟Ⅰ型毒株与Ⅱ型毒株的双重荧光探针引物组合、试剂盒及其应用。

技术介绍

[0002]非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)引起猪的一种急性、发热、高度接触传染性疾病。家猪与野猪普遍易感，软蜱为ASFV的贮藏宿主和媒介。非洲猪瘟病毒只有一种血清型，根据保守区域的B646L基因(编码P72蛋白)可将ASFV的基因组分为24种不同的基因型。1957年，非洲猪瘟病毒基因I型首次从非洲大陆传出，先后在欧洲、拉丁美洲流行，迄今仍在非洲和意大利撒丁岛等地呈地方性流行。2007年，非洲猪瘟病毒基因II型首次从非洲大陆蔓延到其他洲，先后在欧洲、亚洲流行。2018年我国报道了首例非洲猪瘟疫情，为基因II型非洲猪瘟病毒。非洲猪瘟病毒的24种基因型中只有基因I型和II型在非洲以外的其他大陆迅速蔓延，通过鉴别基因型，可以追溯疫源及其可能的传播方式，从而及时采取防控措施。
[0003]I型非洲猪瘟病毒OURT88/3株是从猪场的软蜱体内分离得到的天然I型弱毒株。经研究表明：OURT88/3株缺失多基因家族MGF360的10L、11L、12L、13L、14L和MGF505/530 1R、2R、3R基因，导致病毒在巨噬细胞或软蜱体内的复制效率降低，同时激发宿主产生较高水平的IFN(Interferon)，这种缺失毒株可以对某些基因型提供一定的攻毒保护能力。除此之外，OURT88/3在EP402R、EP153R等基因出现移码，导致无法表达毒力蛋白CD2v，因此在感染家猪后不能引起临床症状和病毒血症。
[0004]目前国内研发的疫苗主要是以非洲猪瘟II型毒株为亲本，构建的MGF360
‑
505R基因缺失和CD2V(EP402R)与MGF360
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505R双基因联合缺失的减毒活疫苗，主要缺失的毒力基因有多基因家族MGF360
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505(MGF360
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9L、MGF360
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10L、MGF360
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11L、MGF360
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12L、MGF360
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13L、MGF360
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14L、505
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1R、505
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2R、505
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3R)和EP402R，因此接种疫苗的猪只与感染I型弱毒株都没有明显的临床症状和病毒血症，给临床的诊断和疫情的防控带来了极大的困难，此外，目前的PCR检测试剂盒多以疫苗缺失的基因片段设计探针引物，从而鉴别野毒与疫苗毒株，然而，非洲猪瘟I型天然弱毒株的缺失片段与疫苗株缺失片段有大量重合的区域，该方法无法鉴别出I型非洲猪瘟天然弱毒株感染，因此建立一种快速、灵敏、准确的鉴别非洲猪瘟I型毒株与II型毒株的方法显得尤为重要。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种鉴别非洲猪瘟Ⅰ型毒株与Ⅱ型毒株的双重荧光探针引物组合、试剂盒及其应用。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0007]一种鉴别非洲猪瘟Ⅰ型毒株与Ⅱ型毒株的双重荧光探针引物组合，包括：用于检测
非洲猪瘟病毒Ⅰ型毒株的引物探针组和用于检测非洲猪瘟病毒通用P72基因的引物探针组；
[0008]所述用于检测非洲猪瘟病毒Ⅰ型毒株的引物探针组，其序列如下：
[0009]上游引物ASFV
‑Ⅰ‑
F：如SEQ ID NO.1所示
[0010]下游引物ASFV
‑Ⅰ‑
R：如SEQ ID NO.2所示
[0011]荧光探物ASFV
‑Ⅰ‑
P：如SEQ ID NO.3所示；
[0012]所述用于检测非洲猪瘟病毒通用P72基因的引物探针组，其序列如下：
[0013]上游引物P72
‑
F：如SEQ ID NO.4所示
[0014]下游引物P72
‑
R：如SEQ ID NO.5所示
[0015]荧光探物P72
‑
P：如SEQ ID NO.6所示。
[0016]进一步地，所述荧光探物为水解探针，所述探针的5
’
端标记有荧光报告基团和3
’
端标记有淬灭基团。
[0017]进一步地，所述荧光报告基团选自FAM、HEX、Cy5、ROX中的任一种；所述淬灭基团选自BHQ1、MGB、BHQ2中的任一种。
[0018]进一步地，不同特异性探针的5
’
端标记荧光报告基团不同。
[0019]一种鉴别非洲猪瘟Ⅰ型毒株与Ⅱ型毒株的试剂盒，包括上述探针引物组合。
[0020]进一步地，所述试剂盒还包括阳性对照和阴性对照。更进一步地，所述阳性对照为含有非洲猪瘟Ⅰ型B117L基因片段和P72基因片段的重组质粒；所述阴性对照为双蒸水。
[0021]一种鉴别非洲猪瘟Ⅰ型毒株与Ⅱ型毒株的方法，该方法是使用上述引物探针组合或上述试剂盒进行实时荧光定量PCR，收集荧光信号，确定受试样品中是否含有非洲猪瘟病毒Ⅰ型毒株和/或Ⅱ型毒株。
[0022]所述实时荧光定量PCR的反应条件为：37℃2min，95℃30s，循环为95℃10s，58℃30s，共计45个循环。
[0023]与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：
[0024]1)本专利技术通过在非洲猪瘟病毒的保守区对Ⅰ型毒株与Ⅱ型毒株的基因组进行分析比对，最终筛选出基因B117L并选择Ⅰ型毒株与Ⅱ型毒株具有较大差异的片段，设计探针引物，同时用淬灭基团MGB提高探针的特异性，从而区分Ⅰ型毒株与Ⅱ型毒株的基因序列。
[0025]2)双重荧光定量实验是在一个反应管中同时扩增2个靶标基因进行定量实验，因此其中一个靶标基因的扩增势必会影响另一个靶标基因的扩增，所以要通过引物设计以及反应条件的优化来同步扩增效率，而不是在同一反应管中将所有引物和模板简单的混合。本专利技术通过引物和探针的设计，在高度保守的序列中，找到合适的引物探针序列且扩增效率接近，过程较困难且结果不易控制，需要进行多次实验，同时通过调整引物与荧光探针的比例，优化反应条件，使样本中两种病毒基因的扩增效率一致，与每个单重反应的灵敏度是一致。
[0026]3)本专利技术的特异性较强，对于猪瘟病毒、猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒、猪蓝耳病毒、猪细小病毒和猪乙型脑炎病毒，均无非特异性扩增曲线，保证检测的准确性；
[0027]4)本专利技术在一次检测操作后，即可鉴别样本中是非洲猪瘟病毒Ⅰ型感染、Ⅱ型感染或两种病毒共同感染，具有灵敏性高、特异性强、重复性好的优点，为猪场非洲猪瘟防控提供技术支持。
附图说明
[0028]为了更清楚地说明本专利技术具体实施方式或现有技术中本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种鉴别非洲猪瘟Ⅰ型毒株与Ⅱ型毒株的双重荧光探针引物组合，其特征在于：包括：用于检测非洲猪瘟病毒Ⅰ型毒株的引物探针组和用于检测非洲猪瘟病毒通用P72基因的引物探针组；所述用于检测非洲猪瘟病毒Ⅰ型毒株的引物探针组，其序列如下：上游引物ASFV
‑Ⅰ‑
F：如SEQ ID NO.1所示下游引物ASFV
‑Ⅰ‑
R：如SEQ ID NO.2所示荧光探物ASFV
‑Ⅰ‑
P：如SEQ ID NO.3所示；所述用于检测非洲猪瘟病毒通用P72基因的引物探针组，其序列如下：上游引物P72
‑
F：如SEQ ID NO.4所示下游引物P72
‑
R：如SEQ ID NO.5所示荧光探物P72
‑
P：如SEQ ID NO.6所示。2.根据权利要求1所述鉴别非洲猪瘟Ⅰ型毒株与Ⅱ型毒株的双重荧光探针引物组合，其特征在于：所述荧光探物为水解探针，所述探针的5
’
端标记有荧光报告基团和3
’
端标记有淬灭基团。3.根据权利要求2所述鉴别非洲猪瘟Ⅰ型毒株与Ⅱ型毒株的双重荧光探针引物组合，其特征在于：所述荧光报告基团选自FAM、HEX、Cy5、ROX中的任一种；所述淬灭基团选自BHQ1、MGB、BHQ2中的任...

【专利技术属性】
技术研发人员：张蓉，毛旭明，凌勇，丁能水，郭泗虎，余杰，龙毅，吴有林，
申请(专利权)人：吉安市傲农现代农业科技有限公司乐山傲农康瑞牧业有限公司泰和县傲牧育种有限公司，
类型：发明
国别省市：