一组检测非洲猪瘟病毒的引物、探针、免提取试剂盒及应用制造技术

本发明专利技术提供一组用于非洲猪瘟病毒检测的引物、探针、免提取试剂盒及其应用，属于分子生物学诊断技术研发领域。本发明专利技术所述的引物、探针位于非洲猪瘟病毒p72基因的保守序列区域内，本发明专利技术采用所述的引物、探针，建立了一种检测非洲猪瘟病毒的荧光定量PCR方法，该方法具有简单快速、特异性强、灵敏度高等特点。同时，本发明专利技术采用所述的引物、探针及建立的方法，组建了免提取核酸的非洲猪瘟病毒检测试剂盒，适用于临床上非洲猪瘟病毒的检测。本发明专利技术为非洲猪瘟的快速、准确的检测及其防控提供了有效的技术手段。技术手段。技术手段。

【技术实现步骤摘要】
一组检测非洲猪瘟病毒的引物、探针、免提取试剂盒及应用


[0001]本专利技术涉及基因检测领域，具体是指一组检测非洲猪瘟病毒的引物、探针、免提取 核酸的试剂盒及应用。

技术介绍

[0002]非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)引起的烈性传染病，发病率和死亡率极高，难以扑灭，严重危害养猪业的健康 发展。该病OIE法定报告动物疫病，被我国列为一类动物传染病。
[0003]ASF疫情导致养猪业产能下降，造成巨大的经济损失。
[0004]ASFV复杂多样的传播方式。猪科哺乳动物是ASFV宿主，包括非洲疣猪、非洲 林猪、非洲红河猪、非洲巨林猪、野猪、野化猪以及家猪等。钝缘蜱是ASFV的另一 类宿主，是其重要的储存宿主。ASFV在钝缘蜱肠道上皮细胞中复制是通过叮咬传播 ASFV的关键，而ASFV也可以经卵传递。
[0005]ASF的防控和净化对我国养猪业生猪产能复苏和健康可持续发展至关重要。建立 一种特异、简便、灵敏的ASF检测方法，对临床不同样品进行快速诊断及明确ASFV 在不同规模养殖场生态环境中的分布、生物媒介携带病原情况等，对构建养殖场立体 生物安全防控策略具有重要的指导意义
[0006]建立一种简便、快速、特异的检测方法，对临床上不同样品的诊断以及明确ASFV 在不同规模养殖场生态环境中的分布、生物媒介携带病原情况等具有重要的支撑作用。 本专利技术提供了一种检测ASFV的引物、探针，建立了ASFV荧光PCR检测方法并组装 了ASFV免提取核酸的检测试剂盒，为ASF防控提供了有效的技术支撑。

技术实现思路

[0007]本专利技术所要解决的技术问题是提供一种能够特异的、灵敏的检测非洲猪瘟病毒的 引物、探针以及一种非洲猪瘟病毒特异性的免提取核酸的荧光PCR检测试剂盒和应用 方法。
[0008]具体的，本专利技术的技术方案为：一组检测非洲猪瘟病毒的引物、探针，根据非洲 猪瘟病毒p72基因的保守序列区域设计，探针5
’
端标记荧光基团，探针3
’
端标记淬灭 基团，所述的引物序列分别为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，所述 的探针为SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。
[0009]优选的是，所述的引物及探针序列分别为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO. 3所述核苷酸序列中的至少一个核苷酸经过缺失和/或替代和/或移位所构成的核苷酸 序列。
[0010]上述任一方案中优选的是，所述荧光基团选自FAM、JOE、VIC、HEX、ROX、 CY3、CY5任意一种。
[0011]上述任一方案中优选的是，所述荧光基团为FAM。
[0012]上述任一方案中优选的是，所述淬灭荧光基团为TAMRA。
[0013]本专利技术还公司一种采用上述任一项所述的引物、探针在制备检测或诊断非洲猪瘟 病毒的试剂中的用途。
[0014]本专利技术还公司一种检测非洲猪瘟病毒的荧光定量PCR试剂盒，采用含有上述任一 项所述的引物、探针。
[0015]优选的是，还包括样品裂解液、荧光PCR反应缓冲液、阳性标准品、阴性对照以 及无RNA酶水。
[0016]上述任一方案中优选的是，所述阳性标准品为含有p72基因部分序列的质粒，其中 非洲猪瘟病毒p72基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0017]本专利技术提供一种荧光PCR方法检测非洲猪瘟病毒的引物及探针，所述引物包括荧 光PCR扩增的上游引物和下游引物，其序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2，所 述探针5
’
端标记FAM荧光基团，3
’
端标记TAMRA淬灭基团，所述探针序列如SEQ IDNO.3。所述引物及探针位于非洲猪瘟病毒p72保守序列区域内。
[0018]本专利技术同时提供一种检测非洲猪瘟病毒的免提取核酸荧光PCR试剂盒，该试剂盒 内包含样品裂解液、荧光PCR反应液、阴性对照样品、阳性对照样品、无，所述荧光 PCR反应液包含权利要求1中的引物及探针。
[0019]进一步，试剂盒荧光PCR反应液中引物浓度为0.24μmoL/L，探针浓度为0.16μ moL/L。
[0020]进一步，试剂盒扩增反应体系共25μL，具体包括：
[0021][0022]进一步，所述的阳性对照样品为含目的基因片段的质粒，阴性对照为无酶水。
[0023]进一步，所述试剂盒的检测应用包括以下步骤：
[0024]步骤(1)样品处理；
[0025]取样本5～10μL放入离心管中，加入50μL裂解液，漩涡振荡，室温或95℃处理 3min；裂解完成后，向离心管中加入稳定缓冲液，漩涡混匀，最后低速瞬时离心；
[0026]步骤(2)取5μL样品处理上清液加入至20μL荧光PCR反应液中，同时向另外 2个PCR反应管中分别加入阴性对照和阳性对照样品各5μL；
[0027]步骤(3)荧光PCR扩增，反应条件包括但不限于：预变性95℃5min，95℃30s， 59℃30s，40个循环，59℃时收集荧光；
[0028]本专利技术提供的引物、探针可应用在非洲猪瘟病毒检测中。
[0029]本专利技术提供的试剂盒可应用在非洲猪瘟病毒检测中。
[0030]本专利技术提供一组用于非洲猪瘟病毒检测的引物、探针、免提取试剂盒及其应用，属 于分子生物学诊断技术研发领域。本专利技术所述的引物、探针位于非洲猪瘟病毒p72基 因的保守序列区域内，本专利技术采用所述的引物、探针，建立了一种检测非洲猪瘟病毒 的荧光定
量PCR方法，该方法具有简单快速、特异性强、灵敏度高等特点。同时，本 专利技术采用所述的引物、探针及建立的方法，组建了免提取核酸的非洲猪瘟病毒检测试 剂盒，适用于临床上非洲猪瘟病毒的检测。本专利技术为非洲猪瘟的快速、准确的检测及 其防控提供了有效的技术手段。
[0031]本专利技术的有益效果具体如下：
[0032]本专利技术的检测非洲猪瘟病毒的引物、探针、免提取核酸的试剂盒，具备以下有益 效果：
[0033](1)高特异性：所述引物、探针具有高特异性，可识别非洲猪瘟病毒p72基因， 保证了荧光PCR的特异性，与其他猪常见的病毒无交叉反应，特异性检测结果见图1。
[0034](2)高敏感性：本专利技术检测灵敏性高，验证结果显示本专利技术的荧光PCR方法最 低可检测到10拷贝/μL标准品，检测方法敏感性结果如图2。
[0035](3)操作简便：本专利技术提供的试剂盒，样品处理简单，检测过程简化，将5μL 加入荧光PCR反应液中即可。
[0036](4)所需设备简单：操作过程中仅需金属浴、小型离心机等简单设备即可，检测 中可适用便携荧光PCR仪，也适用实验室较大型的荧光PCR仪，能够较好地满足非洲 猪瘟病毒现场检测需求或实验室检测需求。
附图说明本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一组检测非洲猪瘟病毒的引物、探针，其特征在于，根据非洲猪瘟病毒p72基因的保守序列区域设计，探针5
’
端标记荧光基团，探针3
’
端标记淬灭基团，所述的引物序列分别为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，所述的探针为SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的检测非洲猪瘟病毒的引物、探针，其特征在于，所述的引物及探针序列分别为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所述核苷酸序列中的至少一个核苷酸经过缺失和/或替代和/或移位所构成的核苷酸序列。3.根据权利要求1所述的检测非洲猪瘟病毒的引物、探针，其特征在于，所述荧光基团选自FAM、JOE、VIC、HEX、ROX、CY3、CY5任意一种。4.根据权利要求3所述的检测非洲猪...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘存，刘砚涵，田野，李云岗，兰邹然，柴士明，孙圣福，张月，汪洋，
申请(专利权)人：山东省动物疫病预防与控制中心，
类型：发明
国别省市：