本发明专利技术提供了一种用于检测复可托原料及其产品中六种猪常见病毒，包括基因膜芯片、杂交试剂和RT
【技术实现步骤摘要】
一种同时检测复可托原料及其产品中六种猪常见病毒的试剂盒
[0001]本专利技术涉及一种基因微阵列的生物芯片，尤其涉及一种同时检测复可托原料及其产品中六种猪常见病毒的试剂盒，属生物芯片和检测试剂
技术介绍
[0002]脾氨肽口服冻干粉(复可托)系自新鲜猪脾经透析提取得到的多肽及核苷酸类物质，加甘露醇作赋形剂制成的冻干品。该药品为免疫调节剂，主要用于治疗细胞免疫功能低下、免疫缺陷和自身免疫功能紊乱性疾病(反复呼吸道感染、支气管炎、肺炎、哮喘、重症带状疱疹及牛皮癣等)；用于恶性肿瘤病人放、化疗及术后生活质量，降低各种原因引起的感冒、发烧或其它感染发生率。主要受众为免疫力低下的婴幼儿、老年人及癌症患者等。复可托提取工艺一般是将新鲜猪脾脏的匀浆液装入透析袋，置冷柜中透析，收集透析液作为原液，原液再经过0.45μm粗滤和0.22μm除菌过滤两道工序，来去除可能含有的病原微生物。该产品不宜进行高温灭菌，因此必须对产品病原微生物的去除效果进行安全性综合评估。
[0003]据动物疫病对猪和人类生产和健康的危害程度，参照农业部发布的《一、二、三类动物疫病病种名录》和《人畜共患传染病名录》，以下六种病原微生物为常见病毒：
[0004](1)口蹄疫
[0005]口蹄疫(foot and mouth disease,FMD)为农业部《一、二、三类动物疫病病种名录》一类动物疫病，且为首选品种，是世界范围内危害和造成经济损失最大的病原体之一，世界动物卫生组织(OIE)将其列为A类传染病之首。
[0006]口蹄疫是由口蹄疫病毒(Foot and Mouth Disease Virus，FMDV)所引起的偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性传染病，人也可以感染。动物临床是以口腔黏膜、蹄部和乳房皮肤发生水疱和溃疡为特征，人表现为口腔黏膜、手掌、足掌和趾间发生水疱和溃疡。口蹄疫病毒属于微RNA病毒科口蹄疫病毒属。病毒呈球形，直径为21～25nm，单股RNA，无囊膜。衣壳蛋白决定其抗原性。口蹄疫病毒对外界环境的抵抗力较强，病毒在组织和污染物中可存活数周至数月，但对高温、紫外线、酸碱敏感。酚、酒精、氯仿等消毒剂对口蹄疫病毒无效。
[0007](2)乙型脑炎
[0008]乙脑(epidemic encephalitis B)为农业部《一、二、三类动物疫病病种名录》二类动物疫病，属于严重危害中枢神经系统的自然源性的人猪共患急性传染病。本病重症病死率高，且易造成不同程度的神经系统后遗症，被世界卫生组织列为重点控制的传染病。
[0009]乙脑病毒属黄病毒科黄病毒属。病毒颗粒呈球型，直径为45～50nm，基因组为单股正链RNA，有传染性。20面体对称，有衣壳。
[0010]乙脑病毒在外界环境中不太稳定，56℃30min即能灭活，pH7以下或pH10以上活性迅速下降，普通消毒剂极易使之灭活。
[0011](3)非洲猪瘟
[0012]非洲猪瘟(英文名称：African Swine fever，简称：ASF)是由非洲猪瘟病毒(英文
名称：African Swine fever virus，简称：ASFV)感染家猪和各种野猪(如非洲野猪、欧洲野猪等)引起一种急性、出血性、烈性传染病。世界动物卫生组织(OIE)将其列为法定报告动物疫病，该病也是我国重点防范的一类动物疫情。
[0013]其特征是发病过程短，最急性和急性感染死亡率高达100％，临床表现为发热(达40～42℃)，心跳加快，呼吸困难，部分咳嗽，眼、鼻有浆液性或粘液性脓性分泌物，皮肤发绀，淋巴结、肾、胃肠粘膜明显出血，非洲猪瘟临床症状与猪瘟症状相似，只能依靠实验室监测确诊。非洲猪瘟病毒是非洲猪瘟科非洲猪瘟病毒属的重要成员，其基因组为双股线状DNA，大小170－190kb。
[0014](4)猪繁殖呼吸障碍综合症
[0015]俗称猪蓝耳病，是猪的一种繁殖障碍性疾病，是由猪繁殖和呼吸障碍综合症病毒(俗称猪蓝耳病病毒，PRRSV)感染引起的疾病。PRRSV为单股正链RNA，不分节段病毒，该病毒属动脉炎病毒科动脉炎病毒属。
[0016](5)猪瘟
[0017]俗称“烂肠病”，是由猪瘟病毒引起的一种急性、发热、接触性传染传染病。具有高度传染性和致死性。本病在自然条件下只感染猪，不同年龄、性别、品种的猪和野猪都易感，一年四季均可发生。该病毒为是ssRNA病毒，黄病毒科瘟病毒属，其RNA为单股正链。
[0018](6)猪伪狂犬病
[0019]猪伪狂犬病是由猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PrV)引起的猪的急性传染病。伪狂犬病毒属于疱疹病毒科(Herpesviridae)、猪疱疹病毒属。猪伪狂犬病，可引起妊娠母猪流产、死胎，公猪不育，新生仔猪大量死亡，育肥猪呼吸困难、生长停滞等，是危害全球养猪业的重大传染病之一。
[0020]目前常用的检测猪病毒性疾病的方法有镜检、分离培养与鉴定、病毒抗原抗体检测和核酸检测(主要为PCR法)等。
[0021](一)镜检
[0022]镜检是快速检测病毒的方法之一。镜检是指在光镜或电镜下，尤其是在电镜下对病毒进行检测，电镜下观察病毒常用磷钨酸进行负染色，不仅能直接观察及检测病毒的形态与结构，也能鉴定病毒。如结合免疫标记法，可进一步提高镜下检出率。此外，观察细胞内有无包涵体的出现，也是检测病毒感染的指标之一。
[0023](二)分离培养与鉴定
[0024]由于病毒只能在活细胞内复制增殖，所以应根据病毒的不同，选择敏感动物、鸡胚或离体组织与细胞，分别进行动物接种、鸡胚接种、组织培养或细胞培养来分离培养病毒。目前，实验室最常用的是细胞培养，常用的细胞有原代细胞、二倍体肾细胞、传代细胞等。病毒在细胞中增殖的指标有：
①
细胞病变效应(CPE)。多数病毒在细胞内增殖，可引起细胞形态学改变，称为细胞病变效应。常见的病变为细胞变圆、坏死、溶解和脱落，有的细胞内出现包涵体，如狂犬病毒。
②
红细胞吸附现象。流感病毒和副流感病毒感染的细胞膜上出现病毒基因编码的抗原，可以与红细胞结合。若向培养瓶内加入红细胞，可见红细胞吸附于细胞膜上，这种现象称为红细胞吸附现象。
[0025](三)病毒抗原抗体检测
[0026]新分离的病毒，根据临床症状和病毒的特性(包括易感宿主动物范围、细胞病变特
征与红细胞吸附现象等)，即可初步鉴定病毒的科属。进一步分型需用特异性抗体进行血清学鉴定。
[0027](四)病毒核酸PCR检测
[0028]病毒核酸PCR检测，针对DNA病毒，先将目的DNA变性为单链模板，加入与单链DNA模板特异性互补的引物。在DNA聚合酶的催化下，单核苷酸从引物3
’
端开始掺入，沿模板5
’‑3’
方向延伸，合成DNA新链。针对RNA病毒，则先将其逆转录为单链DNA，再加入引物按常规PCR方法进行检测。
[0029]现有的PCR方法能够本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种同时检测复可托原料及其产品中六种猪常见病毒的试剂盒，包括基因膜芯片、杂交试剂和RT
‑
PCR反应试剂；(1)所述基因膜芯片包括尼龙膜基片和在尼龙膜基片上阵列式分布的寡核苷酸探针、对照探针及空白的点涂层；具体为六条病毒组特异性检测探针、一条内参探针、一条阳性对照探针和空白点样液阴性对照，其中，
①
所述六条病毒组特异性检测探针的基因序列为：PRRSV探针：NH2‑
C6 GGATGTACTTGCGGCCTAGCAAGCACSFV探针：NH2‑
C6 GGTACGACCTGATAGGGTGCTGCAGAGGCCCACASFV探针：NH2‑
C6 TTCTCTTGCTCTGGATACGTTAATATGAJEV探针：NH2‑
C6 CATTCTCRTCCCARGGTCCCTGGTTTTGTGTCCFMDV探针：NH2‑
C6 GGCGAGTCCTGCCACRGAGATCAACTTCPRV探针：NH2‑
C6 GTCACCTTGTGGTTGTTGCGCACGTACTCG
②
所述一条内参探针的基因序列为：内参探针：NH2‑
C6 AGGGTTCGTTTGTTCAACGATTAATAGT
③
所述一条阳性对照探针的基因序列为：PC探针：NH2‑
C6 CGGGTTAATGCGCGATTGTCACCACACGTTGCG(2)所述RT
‑
PCR反应试剂包括七重引物对组合，各对引物的序列从5
’‑3’
如下：内参：正向引物：ACGACCTCGATGTTGGATCAG反向引物：biotin
‑
GGTCTGAACTCAGATCACGTA...
【专利技术属性】
技术研发人员：洪亮，潘映秋，王福云，
申请(专利权)人：台州市药品检验研究院，
类型：发明
国别省市：
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