一种快速区分猪圆环病毒1型、2b型和嵌合型猪圆环病毒C1-233株的引物及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种快速区分猪圆环病毒1型、2b型和嵌合型猪圆环病毒C1

【技术实现步骤摘要】
一种快速区分猪圆环病毒1型、2b型和嵌合型猪圆环病毒C1
‑
233株的引物及其应用


[0001]本专利技术属于生物
，尤其涉及一种快速区分猪圆环病毒1型、2b型和嵌合型猪圆环病毒C1
‑
233株的引物及其应用。

技术介绍

[0002]猪圆环病毒1型(Porcine circovirus 1,PCV1)毒株和猪圆环病毒2型(Porcine circovirus 2,PCV2)毒株属于圆环病毒科、圆环病毒属，其中猪圆环病毒1型无致病性，猪圆环病毒2型是断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的主要病原。嵌合型猪圆环病毒C1
‑
233株为活疫苗株。猪圆环病毒1型毒株，基因组大小为1759bp；猪圆环病毒2b型0233株和嵌合型猪圆环病毒C1
‑
233株，基因组大小均为1767bp。目前，猪圆环病毒的检测方法主要是PCR结合基因测序方法，但当同一样品中同时存在PCV1、PCV2两种毒株时，应用该方法无法区别，原因是PCV1、PCV2毒株的基因组同源性在70％以上，普通PCR均能扩增出来，且其基因组大小相似，无法通过凝胶电泳区分开；即使将扩增产物测序，由于其同源性高，出现重叠峰，亦无法将其区分开。嵌合型猪圆环病毒活疫苗C1
‑
233株在PCV1基因组骨架上替换其Cap蛋白编码基因ORF2构建而成，其基因组与亲本株PCV1、PCV2的同源性同样很高，用上述方法依然无法区分混合样品中的疫苗株与亲本株。建立区分PCV1、PCV2、PCV1r/>‑
233株简便方法的意义在于且不限于：(1)嵌合型猪圆环病毒活疫苗(C1
‑
233株)研制过程中，需要杜绝亲本株污染，必须对疫苗株中可能污染的亲本株进行甄别；(2)一旦嵌合型猪圆环病毒活疫苗(C1
‑
233株)投入使用，临床上出现疫苗株、野毒株混合感染的可能性较大，同样需要区分疫苗株与野毒株。目前，如需达到上述目标，可行的方法唯有高通量测序。但高通量测序不仅成本高、耗时长，也无法满足基层实验室对临床样品的检测需求。因此，专利技术一种操作简便、快速、准确区分混合样品中猪圆环病毒1型毒株、猪圆环病毒2b型0233株和嵌合型猪圆环病毒C1
‑
233株的检测方法显得极为重要。

技术实现思路

[0003]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种能够快速、准确区分猪圆环病毒1型毒株、2b型0233株和嵌合型猪圆环病毒C1
‑
233株的引物。
[0004]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供了以下技术方案：
[0005]本专利技术提供了一种快速区分猪圆环病毒1型毒株、2b型0233株和嵌合型猪圆环病毒C1
‑
233株的引物，所述引物的上游引物为5
’‑
TGT CCCAGC TGTAGAAGC TCT
‑3’
，所述引物的下游引物为5
’‑
GCA GTT GAG GAG TAC CATTCC
‑3’
。
[0006]本专利技术还提供了一种上述引物在制备快速区分猪圆环病毒1型毒株、2b型0233株和嵌合型猪圆环病毒C1
‑
233株产品中的应用。
[0007]本专利技术还提供了一种快速区分猪圆环病毒1型毒株、2b型0233株和嵌合型猪圆环病毒C1
‑
233株的方法，所述方法包括如下步骤：采用上述引物对待测物基因进行PCR扩增，
NO.1)，所述引物的下游引物为5
’‑
GCA GTT GAG GAG TAC CATTCC
‑3’
(SEQ ID NO.2)。
[0021]采用本专利技术提供的上述引物扩增获得目的基因序列后，只需要使用一种限制性内切酶Ssp I进行酶切，酶切后进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳条带便能快速、准确区分混合样品中猪圆环病毒1型、猪圆环病毒2b型0233株和嵌合型猪圆环病毒C1
‑
233株，具有成本低、快速，且适合基层实验室应用的优点。
[0022]本专利技术还提供了一种上述引物在制备快速区分猪圆环病毒1型毒株、2b型0233株和嵌合型猪圆环病毒C1
‑
233株产品中的应用。
[0023]本专利技术对于产品的具体种类没有特殊限定，包括试剂、试剂盒、探针等。
[0024]本专利技术还提供了一种快速区分猪圆环病毒1型毒株、2b型0233株和嵌合型猪圆环病毒C1
‑
233株的方法，所述方法包括如下步骤：采用上述引物对待测物基因进行PCR扩增，利用限制性内切酶Ssp I对PCR扩增产物进行酶切，然后进行琼脂糖凝胶电泳，猪圆环病毒1型毒株为1759bp单一条带，猪圆环病毒2b型0233株为659bp、594bp和514bp三条带，嵌合型猪圆环病毒C1
‑
233株为1098bp和669bp两条带。
[0025]在本专利技术中，所述PCR扩增的反应体系优选的包括：终浓度为0.4μM的上、下游引物，DNA模板，2
×
Taq MasterMix和无菌双蒸水，本专利技术对于上述各原料的来源没有特殊限定，所述2
×
Taq MasterMix优选的为2
×
TaqMasterMix(Dye Plus)。在本专利技术中，所述终浓度为0.4μM的上、下游引物，DNA模板，2
×
TaqMasterMix和无菌双蒸水的体积比优选为0.1
‑
1：1
‑
5：12.5：5.5
‑
11.3，在本专利技术具体实施例中，PCR扩增的反应体系为25μL，所述终浓度为0.4μM的上、下游引物，DNA模板，2
×
Taq MasterMix和无菌双蒸水分别为1μL、2μL、12.5μL和8.5μL。所述PCR的反应条件优选的包括：95℃预变性5min；95℃变性30s，52
‑
58℃退火30
‑
60s，72℃延伸1min46s
‑
2min，35个循环；72℃延伸5min，12℃保存，更优选的包括：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，35个循环；72℃延伸5min，12℃保存。
[0026]在本专利技术中，所述酶切的方法优选的包括如下步骤：将PCR扩增产物与10
×
Ssp I Buffer、Ssp I和无菌双蒸水混合，孵育。在本专利技术进行酶切时，所述PCR扩增产物与10
×
Ssp I Buffer和Ssp I的质量体积比优选为1
‑
2μg：2μL：1
‑
2μL，本专利技术对于上述各原料的具体来源没有特殊限定，采用本领域常规市售产品均可。在本专利技术中，所述孵育的温度优选为37℃，所述孵育的时间优选为2
‑
3h。本专利技术对于孵育的具体方式本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种快速区分猪圆环病毒1型毒株、2b型0233株和嵌合型猪圆环病毒C1
‑
233株的引物，其特征在于，所述引物的上游引物为5
’‑
TGT CCCAGC TGTAGAAGC TCT
‑3’
，所述引物的下游引物为5
’‑
GCA GTT GAG GAG TAC CATTCC
‑3’
。2.权利要求1所述引物在制备快速区分猪圆环病毒1型毒株、2b型0233株和嵌合型猪圆环病毒C1
‑
233株产品中的应用。3.一种快速区分猪圆环病毒1型毒株、2b型0233株和嵌合型猪圆环病毒C1
‑
233株的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：采用权利要求1所述引物对待测物基因进行PCR扩增，利用限制性内切酶Ssp I对PCR扩增产物进行酶切，然后进行琼脂糖凝胶电泳，猪圆环病毒1型毒株为1759bp单一条带，猪圆环病毒2b型0233株为659bp、594bp和514bp三条带，嵌合型猪圆环病毒C1
‑
233株为1098bp和669bp两条带。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述PCR的反应体系包括：终浓度为0.4μM的上、下游引物，DNA模板，2
×
Taq MasterMix...

【专利技术属性】
技术研发人员：高崧，潘昊纯，郇长超，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：