一种水禽细小病毒、鸭肠炎病毒及鹅星状病毒的多重PCR检测引物组、试剂盒和检测方法技术

本发明专利技术涉及生物检测技术领域，具体公开了一种水禽细小病毒、鸭肠炎病毒及鹅星状病毒的多重PCR检测引物组、试剂盒和检测方法，本发明专利技术所述的多重PCR检测引物组、试剂盒和检测方法，是通过在一个PCR管内一次完成多重PCR扩增，能同时检测GPV、MDPV、DEV、GAstV四种病毒，且对鸭坦布苏病毒、番鸭呼肠孤病毒、鸭III型肝炎病毒、鸭圆环病毒的检测为阴性，检测灵敏度高、特异性强、可重复性好，大大提高了四种病毒的检出效率；同时利用该多重PCR反应体系进行检测，可以有效节约PCR和电泳试剂、实验耗材、减少电泳检测时间及成本。泳检测时间及成本。泳检测时间及成本。

【技术实现步骤摘要】
一种水禽细小病毒、鸭肠炎病毒及鹅星状病毒的多重PCR检测引物组、试剂盒和检测方法


[0001]本专利技术涉及生物检测
，更具体地说，它涉及一种水禽细小病毒、鸭肠炎病毒及鹅星状病毒的多重PCR检测引物组、试剂盒和检测方法。

技术介绍

[0002]水禽细小病毒主要包括鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV)和番鸭细小病毒(Muscovy duck parvovirus,MDPV)，二者均属于细小病毒科、细小病毒属，是目前动物病毒中较小的一类单链DNA病毒。MDPV仅可感染番鸭，而GPV宿主则较为广泛包括鹅和番鸭，新型GPV还可导致鸭的短喙侏儒综合征。鸭肠炎病毒(Duck enteritis virus，DEV)疱疹病毒科，马立克病毒属，核酸为线状、双股DNA，可感染鸭及鹅等水禽动物。鹅星状病毒(Goose astrovirus,GAstV)属于星状病毒科，禽星状病毒属，是一种无囊膜的单股正链RNA病毒，鹅、鸭均可感染。
[0003]现有技术中检测水禽细小病毒、鸭肠炎病毒及鹅星状病毒，需要设计GPV、MDPV、DEV、GAstV的特异鉴定引物4对，进行4次PCR扩增。该方法存在检测时间长，检测成本高，操作复杂，检测灵敏度有限等缺陷。

技术实现思路

[0004]为了获得检测操作简便快速，检测灵敏度高、特异性强、可重复性好，可同时快速准确地检出水禽细小病毒、鸭肠炎病毒及鹅星状病毒的系统，本专利技术提供了一种水禽细小病毒、鸭肠炎病毒及鹅星状病毒的多重PCR检测引物组、试剂盒和检测方法。
[0005]第一方面，本专利技术提供一种水禽细小病毒、鸭肠炎病毒及鹅星状病毒的多重PCR检测引物组，采用如下的技术方案：
[0006]一种水禽细小病毒、鸭肠炎病毒及鹅星状病毒的多重PCR检测引物组，所述多重PCR检测引物组包括以下三组：
[0007](1)用于检测水禽细小病毒的引物组，由GPV
‑
MDPV
‑
F和GPV
‑
MDPV
‑
R组成的引物组，其中：
[0008]GPV
‑
MDPV
‑
F的核苷酸序列为：
[0009]5’‑
TGGAAGAAGGCAGTGAGT
‑3’
；
[0010]GPV
‑
MDPV
‑
R的核苷酸序列为：
[0011]5’‑
AGGTCCGTAGAGCCATAT
‑3’
；
[0012](2)用于检测鸭肠炎病毒的引物组，由DEV
‑
F和DEV
‑
R组成的引物组，其中：
[0013]DEV
‑
F的核苷酸序列为：
[0014]5’‑
CCAAGATACCAGTGATGC
‑3’
；
[0015]DEV
‑
R的核苷酸序列为：
[0016]5’‑
ACCTACAATTCAGCAACG
‑3’
；
[0017](3)用于检测鹅星状病毒的引物组，由GAstV
‑
F和GAstV
‑
R组成的引物组，其中：
[0018]GAstV
‑
F的核苷酸序列为：
[0019]5’‑
TCATTACGAGCAGGAGAA
‑3’
；
[0020]GAstV
‑
R的核苷酸序列为：
[0021]5’‑
CTGCACCGCAACTTTAAA
‑3’
。
[0022]优选的，所述用于检测水禽细小病毒的引物组，其检测靶标基因为Rep1基因，引物大小为746bp。
[0023]优选的，所述用于检测鸭肠炎病毒的引物组，其检测靶标基因为UL54基因，引物大小为641bp。
[0024]优选的，所述用于检测鹅星状病毒的引物组，其检测靶标基因为ORF1a基因，引物大小为460bp。
[0025]第二方面，本专利技术提供一种水禽细小病毒、鸭肠炎病毒及鹅星状病毒的多重PCR检测方法，采用如下的技术方案：
[0026]一种水禽细小病毒、鸭肠炎病毒及鹅星状病毒的多重PCR检测方法，包括以下步骤：
[0027]S1、质粒标准品的制备及提取
[0028]S11、取GPV和MDPV毒株、DEV毒株、GAstV毒株，按照DNA/RNA提取试剂盒说明书提取核酸，RNA样品按试剂盒说明书逆转录合成cDNA第一链备用，利用设计的三组引物，进行PCR扩增；
[0029]S12、回收、纯化PCR产物，并连接至pUC57载体，转化后构建pUC
‑
GPV
‑
MDPV、pUC
‑
DEV、pUC
‑
GAstV共三种重组质粒，并将重组质粒菌液送至生工生物工程(南京)股份有限公司测序鉴定；
[0030]S13、按照质粒提取试剂盒说明书提取质粒DNA，采用核酸浓度测定仪测定质粒DNA浓度；
[0031]S2、多重PCR方法的建立
[0032]S21、多重PCR反应体系：Premix Taq
TM 10μL，上游引物(20μM)1μL，下游引物(20μM)1μL，DNA模板0.5μL，ddH2O补充至20μL；设置退火温度分别为48℃、49.2℃、51.8℃、53.2℃、56.2℃、58.8℃、60℃；设置GPV
‑
MDPV、GAstV、DEV引物浓度比分别为1:4:5、3:2:3、5:1:1、2:4:5、4:5:2；
[0033]S22、通过优化，筛选出多重PCR最适反应条件，其中退火温度为56.2℃；GPV
‑
MDPV、GAstV、DEV引物(20μM)体积比为1:4:5；反应体系为Premix Taq
TM 10μL，每种病毒模板0.5μL，ddH2O补至20μL。最佳扩增条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，56.2℃退火30s，72℃延伸90s，共35个循环；72℃终延伸10min。
[0034]第三方面，本专利技术提供一种水禽细小病毒、鸭肠炎病毒及鹅星状病毒的多重PCR检测试剂盒，采用如下的技术方案：
[0035]一种水禽细小病毒、鸭肠炎病毒及鹅星状病毒的多重PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括质粒标准品、三组多重PCR检测引物组、PCR试剂及多重PCR反应体系和最适反应条件。
[0036]本专利技术根据GPV和MDPV基因组序列特征的设计了通用型水禽细小病毒PCR检测引物，检测靶标基因为Rep1基因，扩增目的基因序列两端较为保守，可用于水禽细小病毒的鉴
定，中间则特异性较强，通过扩增产物的测序分析可进一步区分GPV和MDPV。同时根据DEV和GAstV基因组序列信息，分别针对UL54和ORF1a基因的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种水禽细小病毒、鸭肠炎病毒及鹅星状病毒的多重PCR检测引物组，其特征在于，所述多重PCR检测引物组包括以下三组：(1)用于检测水禽细小病毒的引物组，由GPV
‑
MDPV
‑
F和GPV
‑
MDPV
‑
R组成的引物组，其中：GPV
‑
MDPV
‑
F的核苷酸序列为：5
’‑
TGGAAGAAGGCAGTGAGT
‑3’
；GPV
‑
MDPV
‑
R的核苷酸序列为：5
’‑
AGGTCCGTAGAGCCATAT
‑3’
；(2)用于检测鸭肠炎病毒的引物组，由DEV
‑
F和DEV
‑
R组成的引物组，其中：DEV
‑
F的核苷酸序列为：5
’‑
CCAAGATACCAGTGATGC
‑3’
；DEV
‑
R的核苷酸序列为：5
’‑
ACCTACAATTCAGCAACG
‑3’
；(3)用于检测鹅星状病毒的引物组，由GAstV
‑
F和GAstV
‑
R组成的引物组，其中：GAstV
‑
F的核苷酸序列为：5
’‑
TCATTACGAGCAGGAGAA
‑3’
；GAstV
‑
R的核苷酸序列为：5
’‑
CTGCACCGCAACTTTAAA
‑3’
。2.根据权利要求1所述的水禽细小病毒、鸭肠炎病毒及鹅星状病毒的多重PCR检测引物组，其特征在于，所述用于检测水禽细小病毒的引物组，其检测靶标基因为Rep1基因，引物大小为746bp。3.根据权利要求1所述的水禽细小病毒、鸭肠炎病毒及鹅星状病毒的多重PCR检测引物组，其特征在于，所述用于检测鸭肠炎病毒的引物组，其检测靶标基因为UL54基因，引物大小为641bp。4.根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：戴银，李梅珍，殷冬冬，尹磊，王洁茹，胡晓苗，赵瑞宏，沈学怀，潘孝成，周学利，侯宏艳，张朝霞，
申请(专利权)人：安徽省农业科学院畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：