一种用于检测水貂圆环病毒的荧光定量PCR引物组和荧光定量PCR试剂盒制造技术

一种用于检测水貂圆环病毒的荧光定量PCR引物组和荧光定量PCR试剂盒，涉及水貂圆环病毒检测领域，包括：MiCV荧光定量PCR反应液、阳性质控品和阴性质控品；MiCV荧光定量PCR反应液包括上下游引物、TBPremix Ex Taq

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测水貂圆环病毒的荧光定量PCR引物组和荧光定量PCR试剂盒


[0001]本专利技术涉及水貂圆环病毒检测
，具体涉及一种用于检测水貂圆环病毒的荧光定量PCR引物组和荧光定量PCR试剂盒。

技术介绍

[0002]水貂圆环病毒(Mink circovirus，MiCV)是近年来被发现的新型圆环病毒，病毒感染水貂后可引起水貂出现食欲不佳、精神倦怠、被毛粗乱和腹泻等症状，且容易引起其他疾病的混合感染。大部分患病水貂可自然康复，康复后消瘦或生长迟缓，除了本身生长不良及貂皮质量明显降低以外，还会影响其产仔数，所生仔貂个体也较小。在病程后期，约7～8％患病水貂粪便从白痢逐渐变为黄痢、红痢，出现脓样(胶胨样)便，继而转变为黑色血便，口鼻苍白，最终甚至死亡。水貂圆环病毒病一般在8～10月份为多发，且可在不同年龄的貂之间相互传播，在我国的流行范围较广且呈逐年增加的趋势。已有流行病学研究结果表明，该病在黑龙江省的阳性率为30.30％，吉林省阳性率为38.46％，山东省的阳性率为52.88％，辽宁省阳性率为58.46％，河北省的阳性率为67.90％。MiCV对养貂业产生了巨大威胁，严重危害了貂场的经济效益。
[0003]目前，对于水貂圆环病毒的研究较少，其致病机制尚不明确，也没有有效的疫苗和药物。因此，建立一种快速有效的检测方法对于疾病防治和流行病学监测具有重要意义。目前，针对MiCV尚无细胞培养系统可用于病毒分离鉴定，迄今为止，建立的用于检测MiCV的方法主要包括常规PCR方法、重组酶聚合酶扩增(RPA)方法、间接酶联免疫吸附法和荧光定量PCR方法等。荧光定量PCR检测方法具有高度特异性、灵敏性、可重复性和定量性等特点，可快速测定不同组织样品中的病毒，该技术已被证明可以诊断多种家畜病毒性的疾病，并已成为兽医病毒学和疾病控制方面的重要工具。

技术实现思路

[0004]随着疾病的流行，MiCV基因组不断发生变异，为提高检测的准确性，本专利技术参考实验室近年来分离的MiCV全基因组序列和GenBank登陆的全部MiCV基因组序列，选择保守区域设计合成特异性引物，通过反应条件优化，建立用于MiCV检测的荧光定量PCR检测方法，并组装试剂盒，为MiCV的防控提供技术支持。
[0005]本专利技术的目的是提供一种用于检测水貂圆环病毒的荧光定量PCR引物组和荧光定量PCR试剂盒，以弥补荧光定量PCR在检测水貂圆环病毒中的应用空白。
[0006]本专利技术为解决技术问题所采用的技术方案如下：
[0007]本专利技术的一种用于检测水貂圆环病毒的荧光定量PCR引物组，引物信息如下：
[0008]上游引物MiCV
‑
F：5'
‑
AGGGCCTTTGGGCATCATTG
‑
3'；
[0009]下游引物MiCV
‑
R：5'
‑
CCCGCCTGCAAACTGAAGAA
‑
3'。
[0010]本专利技术的一种用于检测水貂圆环病毒的荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒的反应总
体系包括：MiCV荧光定量PCR反应液、阳性质控品和阴性质控品；所述MiCV荧光定量PCR反应液包括上游引物、下游引物、TBPremix Ex Taq
TM
II和ddH2O；
[0011]所述上游引物MiCV
‑
F：5'
‑
AGGGCCTTTGGGCATCATTG
‑
3'；
[0012]所述下游引物MiCV
‑
R：5'
‑
CCCGCCTGCAAACTGAAGAA
‑
3'。
[0013]3、根据权利要求2所述的一种用于检测水貂圆环病毒的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，在每个反应总体系中，所述MiCV荧光定量PCR反应液的总用量为22μL；其中，所述上游引物用量为1μL，所述下游引物用量为1μL，所述TBPremix Ex Taq
TM
II用量为12.5μL，所述ddH2O用量为7.5μL。
[0014]作为优选的实施方式，所述上游引物浓度为10μmol/L。
[0015]作为优选的实施方式，所述下游引物浓度为10μmol/L。
[0016]作为优选的实施方式，所述阳性质控品为含有水貂圆环病毒Cap基因保守序列的pMD18
‑
T载体质粒。
[0017]作为优选的实施方式，所述阳性质控品浓度为1
×
106个拷贝/μL。
[0018]作为优选的实施方式，所述阴性质控品为DEPC水。
[0019]本专利技术的有益效果是：
[0020]本专利技术根据水貂圆环病毒(MiCV)的Cap基因保守序列设计引物，通过反应体系和反应条件的优化，建立了基于SYBR Green II的实时荧光定量PCR技术并组装试剂盒，通过所构建的上下游引物以及所组装的荧光定量PCR试剂盒，能够实时、快速测定MiCV，该试剂盒不但稳定性好，而且具有较高的敏感性和特异性，可为水貂圆环病毒(MiCV)的诊断及流行病学调查提供更大的技术支持。
附图说明
[0021]图1为实施例2中Cap基因的PCR扩增结果。图中，M：DL 2000bp DNA Marker；1：Cap基因PCR扩增片段；2：阴性对照。
[0022]图2为实施例3中引物浓度优化结果。图中，a～e(由左至右)分别表示引物终浓度依次为400nM、500nM、300nM、200nM和100nM的优化结果。
[0023]图3为实施例3中退火温度优化结果。图中，a～f(由左至右)分别表示退火温度依次为57℃、58℃、56℃、55℃、59℃和60℃的优化结果。
[0024]图4为实施例3中重组阳性质粒扩增曲线。图中，a～f(由左至右)分别表示模板浓度依次为1.0
×
106拷贝/μL、1.0
×
105拷贝/μL、1.0
×
104拷贝/μL、1.0
×
103拷贝/μL、1.0
×
102拷贝/μL和1.0
×
101拷贝/μL。
[0025]图5为实施例3中荧光定量PCR标准曲线。
[0026]图6为实施例3中荧光定量PCR熔解曲线。
[0027]图7为实施例3中荧光定量PCR特异性扩增曲线。
[0028]图8为实施例3中荧光定量PCR敏感性扩增曲线。图中，a～e(由左至右)分别表示模板浓度依次为1.0
×
105拷贝/μL、1.0
×
104拷贝/μL、1.0
×
103拷贝/μL、1.0
×
102拷贝/μL、1.0
×
101拷贝/μL、1.0
×
100拷贝/μL的敏感性扩增曲线。
[0029]图9为普通PCR敏感性试验结果。本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测水貂圆环病毒的荧光定量PCR引物组，其特征在于，引物信息如下：上游引物MiCV
‑
F：5'
‑
AGGGCCTTTGGGCATCATTG
‑
3'；下游引物MiCV
‑
R：5'
‑
CCCGCCTGCAAACTGAAGAA
‑
3'。2.一种用于检测水貂圆环病毒的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，该试剂盒的反应总体系包括：MiCV荧光定量PCR反应液、阳性质控品和阴性质控品；所述MiCV荧光定量PCR反应液包括上游引物、下游引物、TBPremix ExTaq
TM II和ddH2O；所述上游引物MiCV
‑
F：5'
‑
AGGGCCTTTGGGCATCATTG
‑
3'；所述下游引物MiCV
‑
R：5'
‑
CCCGCCTGCAAACTGAAGAA
‑
3'。3.根据权利要求2所述的一种...

【专利技术属性】
技术研发人员：冷雪，杜锐，李健明，时坤，盛陈艳，宫庆龙，刘菲，麻宝艺，孙志博，
申请(专利权)人：吉林农业大学，
类型：发明
国别省市：