一种规模猪场猪伪狂犬病、猪圆环病的净化创建方法技术

本发明专利技术公开了一种规模场猪伪狂犬病、猪圆环病的净化创建方法，涉及动物疫病防控方法领域，包括以下步骤：S1、对本场种猪进行伪狂犬病毒gE基因缺失疫苗、圆环病毒疫苗接种；S2、步骤1的疫苗接种后开始周期性地进行包括免疫抗体检测、PCR病原学检测、圈舍消毒操作，对本场猪群进行净化；S2所述PCR病原学检测，采用猪伪狂犬病毒疫苗株、伪狂犬病毒野毒和圆环病毒多重TaqMan

【技术实现步骤摘要】
一种规模猪场猪伪狂犬病、猪圆环病的净化创建方法


[0001]本专利技术涉及动物疫病防控方法领域，具体涉及一种规模猪场猪伪狂犬病、猪圆环病的净化创建方法。

技术介绍

[0002]猪伪狂犬病是由猪伪狂犬病病毒引起，病猪以及带毒猪的鼻腔分泌物、尿液、精液、粪便等都是本病的传染源。另外，与病猪、带毒猪接触的人员衣物、器械、进出的车辆等也可成为传染源。并且后者因为流动性更大，所以可以将病毒的传播范围扩大，产生更多的感染病例。猪感染伪狂犬病毒后终生带毒，同时可持续排毒。病毒通过呼吸道、皮肤伤口或黏膜等侵入机体造成感染。猪伪狂犬也可通过垂直传播，受到感染的妊娠母猪可经胎盘垂直传播，使胎儿感染病毒。赵新霞等2016年1月至2019年12月在贵州的1679份无害化处理厂的样品进行PRV病原样品检测，PRV阳性率为21.91％(赵新霞等，2020)，说明本病流行广泛。该病在猪群中可短时间内呈暴发性流行，可引起妊娠母猪流产、死胎，公猪不育，新生仔猪大量死亡，育肥猪呼吸困难、生长停滞等。鉴于猪伪狂犬病的传播速度及其对猪的影响，它已经成为危害全球养猪业的重大传染病之一。
[0003]目前，对猪伪狂犬病的防控方法，主要集中在免疫监测、净化阳性个体、隔离饲养等等，对防控方法的改进也主要集中在对这些步骤和参数等进行调整，我们对现有的防控方法进行了研究，发现在现有框架内已经很难再有所突破。我们还发现，在上述防控过程中，免疫监测步骤通常采取血清免疫抗体检测法，该方法因其检测速度快，被广泛应用于大规模检测活动中，但其具有准确率相对较低、假阳性高、样品不容易处理等问题，进而由此对整体的防控效果(防控后的阳性率、疫情暴发情况、种群免疫力等)造成不良影响。
[0004]另外，目前大多数猪场使用伪狂犬弱毒株疫苗进行免疫，但在免疫前期猪群仍可能感染伪狂犬野毒，给早期疫病诊断带来困难。目前对伪狂犬弱毒株与野毒的荧光PCR早期鉴别方法较少，且敏感性、特异性较差，本试验建立的多重TaqMan
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MGB荧光定量PCR检测方法，特异性强、敏感性高，能区分野毒感染与疫苗毒感染，为伪狂犬净化提供技术支撑。
[0005]猪圆环病毒(PCV)是迄今发现的一种最小的动物病毒。现已知PCV有两个血清型，即PCV1、PCV2和PCV3。PCV1为非致病性的病毒。PCV2和PCV3传播方式主要以水平传播和垂直传播为主。水平传播主要通过患病猪只的鼻腔、粪便、尿液、唾液传播，垂直传播可以穿透母猪的胎盘屏障从而引起胎儿流产、死胎和木乃伊胎。临床上，PCV除引起母猪繁殖障碍，还能引起断奶仔猪多系统衰弱综合征。猪圆环病流行严重，Ku等人研究发现，临床检测样本中PCV2阳性率为62.2％、PCV3阳性率为34.7％，PCV2和PCV3混合感染的阳性率为15.8％(Ku et al.,2017)。PCV还能引起猪免疫抑制而继发细菌和其他病毒感染时，对我国养猪业造成严重危害。PCV和PRV对我国养猪业危害严重，临床症状相似，且经常混合感染，给猪场疫病净化带来较大难度。
[0006]PCR检测，是猪伪狂犬病、猪圆环病的重要鉴定方法之一，也是目前较为广泛应用、准确率较高的方法。利用PCR可从患病动物的分泌物如鼻咽拭子或组织病料中扩增猪伪狂
犬病病毒的基因，从而对患病动物进行确诊。PCR与病毒分离鉴定相比，具有快速、敏感、特异性强等优点，能同时检测大批量的样品，并且能进行活体检测，适合于临诊诊断。但目前PCR检测上述病毒，主要采用普通凝胶PCR法，荧光PCR多采用SYBR Green染料法、TaqMan探针法，普遍存在可检测靶基因范围过大，反应的荧光本底高，从而导致检测方法特异性、稳定性和分辨率不高的等问题。
[0007]另外，上述疫病传染性较强、致死率较高等特点，对病猪的筛查速度和筛查准确率都提出了较高的要求。

技术实现思路

[0008]基于现有技术中存在的上述问题，我们改进了检测猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒PCR方法，采用TaqMan
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MGB探针，在Taq
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Man探针的3端加入一个能插入DNA小沟的二氢环化吲哚卟啉
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三肽(DPI3)，可以使大大提高探针的TM值，增加杂交反应的特异性，得到了一种特异性强、敏感性高、稳定性高、检测速度快的同时检测猪伪狂犬病毒疫苗株、伪狂犬病毒野毒和猪圆环病毒检测方法，并将其应用到大规模检测净化中，用于规模场猪伪狂犬病和圆环病毒防控，得到了非常好的效果，方案如下：
[0009]本专利技术提供一种规模场猪伪狂犬病、猪圆环病的净化创建方法，包括以下步骤：
[0010]S1、对本场种猪进行伪狂犬病毒gE基因缺失疫苗、圆环病毒疫苗接种；
[0011]S2、步骤1的疫苗接种后开始周期性地进行包括免疫抗体检测、PCR病原学检测、圈舍消毒操作，对本场猪群进行净化；
[0012]S2所述PCR病原学检测，采用多重猪伪狂犬、猪圆环病毒TaqMan
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MGB荧光定量PCR方法，分别检测猪伪狂犬病毒gB基因、伪狂犬病毒gE基因和猪圆环病毒ORF1基因，可在病原学上区分伪狂犬病毒疫苗株、伪狂犬野毒和猪圆环病毒；
[0013]每年重复2
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3次上述S1、S2。
[0014]优选地，S1根据抗体检测情况，每年免疫2
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3次。
[0015]优选地，S2所述免疫抗体检测，采集血清进行ELISA试验，检测猪伪狂犬和猪圆环抗体，对免疫抗体不合格的加强免疫1次，加强免疫检测仍不合格的进行淘汰。
[0016]所述多重猪伪狂犬病毒疫苗株、伪狂犬病毒野毒和猪圆环病毒TaqMan
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MGB荧光定量PCR检测方法，为多重实时荧光定量PCR同时检测猪伪狂犬病毒疫苗株、伪狂犬野毒和猪圆环病毒的方法，包括以下步骤：
[0017](1)采集样本，预处理；
[0018](2)对预处理过的动物样本进行核酸提取；
[0019](3)分别采用SEQ ID NO.1
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3所示引物对及探针、SEQ ID NO.4
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6所示引物对及探针、SEQ ID NO.7
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9所示引物对及探针进行荧光PCR扩增。
[0020](4)通过荧光PCR试验结果判定样本是否为猪伪狂犬病毒疫苗株、猪伪狂犬病毒野毒和猪圆环病毒阳性。
[0021]优选地，步骤(4)所述猪伪狂犬判定方法包括：阴性对照无CT值并且无扩增曲线。同时阳性对照的CT值应≤30.0，并出现特定的扩增曲线，试验成立。伪狂犬gE样品CT值≤30，结果判为阳性，30＜CT值＜36，判定可疑，需重新试验，检测结果仍为阳性判定为阳性，阴性判定为阴性，CT值≥36，判定为阴性。伪狂犬gB样品CT值≤30，结果判为阳性，30＜CT值
＜36，判定可疑，需重新试验，检测结果仍为阳性判定为阳性，阴性判定为阴性，CT值≥37，判定为阴性。
[0022]疫苗毒和野毒判定：伪狂犬gB基本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种规模场猪伪狂犬病、猪圆环病的净化创建方法，其特征在于：包括以下步骤：S1、对本场种猪进行伪狂犬病毒gE基因缺失疫苗、圆环病毒疫苗接种；S2、步骤1的疫苗接种后开始周期性地进行包括免疫抗体检测、PCR病原学检测、淘汰阳性猪、加强免疫疫苗接种、圈舍消毒操作，对本场种猪群进行净化；S2所述PCR病原学检测采用猪伪狂犬病毒疫苗株、伪狂犬野毒和圆环病毒多重TaqMan
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MGB荧光定量PCR检测方法；每年重复2
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3次上述S1、S2。2.根据权利要求1所述的规模场猪伪狂犬病、猪圆环病的净化创建方法，其特征在于：所述猪伪狂犬病毒疫苗株、伪狂犬病毒野毒和圆环病毒多重TaqMan
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MGB荧光定量PCR检测方法，为多重实时荧光定量PCR同时检测猪伪狂犬病毒疫苗株、伪狂犬病毒野毒和猪圆环病毒的方法，包括以下步骤：(1)采集样本，预处理；(2)对预处理过的动物样本进行核酸提取；(3)分别采用SEQ ID NO.1
‑
3所示引物对及探针、SEQ ID NO.4
‑
6、SEQ ID NO.7
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9所示引物对及探针进行荧光PCR扩增；(4)通过荧光PCR试验结果判定样本是否为猪伪狂犬病毒疫苗株、伪狂犬病毒野毒、猪圆环病毒阳性。3.根据权利要求2所述的规模场猪伪狂犬病、猪圆环病的净化创建方法，其特征在于：步骤(4)所述猪伪狂犬病判定方法包括：阴性对照无CT值并且无扩增曲线，同时阳性对照的CT值应≤30.0，并出现特定的扩增曲线，试验成立。伪狂犬gE样品CT值≤30，结果判为阳性，30＜CT值＜36，判定可疑，需重新试验，检测结果仍为阳性判定为阳性，阴性判定为阴性，CT值≥36，判定为阴性。伪狂犬gB样品CT值≤30，结果判为阳性，30＜CT值＜36，判定可疑，需重新试验，检测结果仍为阳性判定为阳性，阴性判定为阴性，CT值≥36，判定为阴性；伪狂犬疫苗株和野毒判定：伪狂犬gB基因CT值为阳性，同时gE基因CT值也为阳性，判定为伪狂犬野毒。伪狂犬gB基因CT值为阳性，同时gE基因CT值为阴性，判定为伪狂犬病毒疫苗株；步骤(4)所述猪圆环病毒判定方法包括：阴性对照无CT值并且无扩增曲线。同时阳性对照的CT值应≤30.0，...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩勇，许崇友，刘玉洁，韩永平，秦培浩，
申请(专利权)人：韩勇，
类型：发明
国别省市：