多种呼吸道病毒核酸质谱检测的引物组合、试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术公开了多种呼吸道病毒核酸质谱检测的引物组合、试剂盒及检测方法，涉及分子生物学检测技术领域。其中，包括48条扩增引物和24条质量探针延伸引物，通过多重PCR技术与MALDI

【技术实现步骤摘要】
多种呼吸道病毒核酸质谱检测的引物组合、试剂盒及检测方法


[0001]本专利技术涉及分子生物学检测
更具体地，涉及一种多种呼吸道病毒核酸质谱检测的引物组合、试剂盒及检测方法。

技术介绍

[0002]能够引起人类呼吸道感染的病原体种类多样，病毒是一个重要致病因素，约有80％的呼吸道感染由呼吸道病毒引起的。这一系列病毒种类繁多，其中最常见，最具有代表性的包括：正黏病毒科(Orthomyxoviridae)的流感病毒(influenzaviruses，IFVs)，副黏病毒科(Paramyxoviridae)的呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)，副流感病毒(parainfluenzaviruses，PIVs)，人偏肺病毒(humanmetapneumovims，HMPV)，小RNA病毒科(Picornaviridae)的人鼻病毒(huamnrhinoviruses，HRVs)，冠状病毒科(Coronaviridae)的人冠状病毒(human coronaviruses，HCoVs)，腺病毒科(Adenoviridae)的腺病毒(adenoviruses，ADVs)，以及细小病毒科(Parvoviridae)的人博卡病毒(human bocavirus，HBOVs)。虽然呼吸道病毒的种类繁多，但其感染有着类似的特点。首先，呼吸道病毒的传染性都很强，非常容易在人群聚集的场所，如学校、医院传播。其次，呼吸道病毒感染引起的症状不特异，大多呈现为上呼吸道感染的症状，如普通感冒、咽喉炎等。第三，人群对于呼吸道病原体普遍易感，病毒变异速度快，由疫苗获得的免疫力并非长久有效，呼吸道感染容易反复发生。尤其2019新型冠状病毒传染性强，传播速度快，特别是免疫力低下者，如老年人，免疫抑制，基础病患者，有时更容易形成继发感染，对肺部及其他器官造成重大损伤，发展成重症，甚至危及生命。
[0003]对呼吸道病毒进行核酸检测，目前的主要方法是荧光定量RT
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PCR方法。但是由于荧光通道的限制，一次只能检测1
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2种病毒，而且每次的样本检测通量低，不利于临床快速准确大规模的进行病例筛查；NGS高通量测序也是检测病毒的一种重要技术，通过全测序可以实现病毒及亚型的准确鉴定，但是实验操作复杂，整体流程时间长，样本检测成本升高。因此对于呼吸道病原体的检测，必须要综合考虑检测重数与检测通量。

技术实现思路

[0004]本专利技术的一个目的在于提供一种用于多种呼吸道病毒核酸质谱检测的引物组合及包含这些引物组合的检测试剂盒，提高对呼吸道病毒的筛查诊断能力。
[0005]本专利技术的另一个目的在于提供一种利用上述试剂盒进行多种呼吸道病毒核酸质谱检测的方法。该方法使得呼吸道病毒检测特异性强，灵敏度高。
[0006]为达到上述目的，本专利技术采用下述技术方案：
[0007]第一方面，本专利技术提供一种用于多种呼吸道病毒核酸质谱检测的引物组合，包括48条扩增引物和24条质量探针延伸引物，其中，扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1
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48所示，具体见表1；质量探针延伸引物的核苷酸序列如SEQ ID No.49
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72所示，具体见表2。
[0008]表1扩增引物序列
[0009][0010][0011]表2质量探针延伸(MPE)引物序列
[0012][0013][0014]本专利技术将多重PCR技术与MALDI
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TOF质谱技术相结合，即采用PCR
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微测序进行多种呼吸道病原体的分型检测。在本专利技术中，通过对20种呼吸道病毒进行序列分析，选定检测靶基因和特异性突变位点，设计了一系列检测20种呼吸道病毒的PCR扩增引物和质量探针延伸(MPE)引物，本专利技术还设置了内参基因人RNaseP和HBB，来监测样本的采样和扩增实验是否成功，大大提高检测灵敏度，并可实现短时间内高通量检测，更适合应用于大规模的病毒疑似病例的检测筛查。
[0015]本专利技术还提供了上述引物组合在制备多种呼吸道病毒核酸质谱检测产品中的应用。
[0016]根据本专利技术的具体实施方式，本专利技术提供一种用于多种呼吸道病毒核酸质谱检测的试剂盒，该试剂盒包括上述引物组合。
[0017]进一步的，所述试剂盒还包括RT
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PCR反应试剂、去磷酸化反应试剂及质量探针延伸反应试剂。
[0018]第二方面，本专利技术提供一种检测多种呼吸道病毒的方法，该方法使用上述试剂盒，具体包括：
[0019](1)利用48条扩增引物对待测样本进行RT
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PCR扩增反应；
[0020](2)对步骤(1)得到的扩增产物利用碱性磷酸酶进行去磷酸化处理；
[0021](3)利用24条质量探针延伸引物对步骤(2)得到去磷酸化产物进行单碱基延伸；
[0022](4)对步骤(3)得到的延伸产物进行树脂脱盐纯化；
[0023](5)质谱检测，确定病原体种类。
[0024]进一步的，所述多种呼吸道病毒为呼吸道合胞病毒A和B(RSV
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A和RSV
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B)、副流感病毒1型至4型(PIV1、PIV2、PIV3、PIV4)、人偏肺病毒A和B(HMPV
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A和HMPV
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B)、人博卡病毒1型和2型(HBoV1和HBoV2)、鼻病毒(HRV)、甲流病毒通用型(FluA)、甲流病毒H1N1(FluA
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H1N1)、甲流病毒H3N2(FluA
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H3N2)、甲流病毒H1N1 2009(FluA
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H1N1 2009)、乙流病毒(FluB)、冠状病毒
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SARS、冠状病毒
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MERS、新型冠状病毒SARS
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CoV
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2和腺病毒(ADV)。
[0025]进一步的，所述质谱检测采用的是基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱MALDI
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sequence Alignment Editor软件进行序列比对，主要对比关键基因，如SARS
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CoV
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2的N，ORF1ab等，选择种内保守，种间特异的靶基因进行检测(见表3)，并选取人RNaseP和HBB为内参。
[0053]采用Primer3在线网页进行多重的PCR引物设计。具体扩增引物见上面的表1。选定检测突变位点，采用基因位点分型系统软件(融智生物科技(青岛)有限公司)进行质量探针延伸(MPE)引物设计，具体见上面的表2。设计完成的PCR引物和MPE引物，分别由生工生物工程(上海)股份有限公司进行质粒合成和引物合成。
[0054]表3病原体对应检测的靶基因
[0055][0056]实施例2检测方法建立
[0057]1.质粒稀释。
[0058]使用水对质粒干粉进行稀释到100本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于多种呼吸道病毒核酸质谱检测的引物组合，其特征在于，包括48条扩增引物和24条质量探针延伸引物，其中，扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1
‑
48所示；质量探针延伸引物的核苷酸序列如SEQ ID No.49
‑
72所示。2.权利要求1所述的引物组合在制备多种呼吸道病毒核酸质谱检测产品中的应用。3.一种用于多种呼吸道病毒核酸质谱检测的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物组合。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括RT
‑
PCR反应试剂、去磷酸化反应试剂及质量探针延伸反应试剂。5.一种检测多种呼吸道病毒的方法，其特征在于，所述方法使用如权利要求3或4所述的试剂盒，包括：(1)利用48条扩增引物对待测样本进行RT
‑
PCR扩增反应；(2)对步骤(1)得到的扩增产物利用碱性磷酸酶进行去磷酸化...

【专利技术属性】
技术研发人员：翟志向，周晓光，宋合兴，李运涛，
申请(专利权)人：广东默迪优谱生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：