检测EBV和HCMV病毒的引物探针组合物及其应用制造技术

本发明专利技术属于生物检测技术领域，具体涉及同时检测EBV病毒和人巨细胞病毒HCMV的引物探针组合物及其应用。本发明专利技术所述的引物组合物互不发生干扰，具有较好的检测灵敏度和准确度，且操作简便，能够广泛应用于EBV病毒和人巨细胞病毒HCMV的临床诊断。病毒HCMV的临床诊断。病毒HCMV的临床诊断。

【技术实现步骤摘要】
检测EBV和HCMV病毒的引物探针组合物及其应用


[0001]本专利技术属于生物检测
，具体涉及一种同时检测EBV病毒和人巨细胞病毒HCMV的引物探针组合物及其应用。

技术介绍

[0002]EB病毒和人巨细胞病毒同属人类疱疹病毒，其中EB病毒(Epstein
‑
Barr Virus，EBV)为人类疱疹病毒属的γ亚科，又名人疱疹病毒4型；人巨细胞病毒(Human Cytomegalovirus，HCMV)为人类疱疹病毒属的β亚科疱疹病毒，又名人疱疹病毒5型。EBV与HCMV均为双链DNA病毒。目前已经发现的疱疹病毒有100种以上，其中与人类感染有关的疱疹病毒至少有8种，包括：HSV
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1、HSV
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2、水痘一带状疱疹病毒(VZV)、EBV、巨细胞病毒(HCMV)和HHV
‑
6、HHV
‑
7、HHV
‑
8。
[0003]8种人类疱疹病毒除具有典型的疱疹病毒形态特征外，最重要的生物学特性是原发感染后病毒在体内持续存在，因此疱疹病毒感染者体内病毒易被周期性激活，病毒激活后仍具有传染性。因此，疱疹病毒感染者随时都可分泌一种或多种疱疹病毒，使得普通人群保持较高的感染率。其中以EBV和HCMV病毒危害最大，已知EBV与非洲Burkitt
’
s淋巴瘤、鼻咽癌和移植后淋巴增生性疾病有关。而HCMV会导致孕妇感染后的胎儿先天畸形甚至死胎。
[0004]EBV和HCMV感染较为普遍，大多数人在少儿期感染过EB和HCMV，多呈无临床症状的急性感染或潜伏感染，同时因感染而获得免疫。在特殊情况下，比如自身免疫缺陷、获得性免疫权限、服用免疫抑制药物等，EB和HCMV病毒会容易活化感染。大多数HCMV感染临床表现与EBV感染相同，这2种病毒是持续发热性疾病的重要病原。在临床检测中，有时仅根据临床表现无法分辨EBV和HCMV感染，需要同时检测EBV和HCMV，此外，也会对艾滋病患者和器官移植患者进行EBV和HCMV的筛查。
[0005]EBV和HCMV感染的诊断包括血清学检查、病毒标志物检查、病毒分离。目前，血清学标志物检测通常作为急性或慢性EBV、HCMV感染的辅助诊断方法，抗VCA
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IgM、HCMV
‑
IgM/IgG检测是急性原发感染的重要指标。但血清学标志物实际上是检测人体对感染的免疫反应状态，无法检测病毒本身，也就无法准确灵敏的反映感染的情况。此外，随着技术的发展，定量检测病毒也逐渐成为可能。例如专利CN201410026784.5公开了一种同时检测常见人疱疹病毒HSV
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1、HSV
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2、EBV和HCMV的实时荧光定量PCR试剂盒，由定量PCR反应液、定量反应液、HSV
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1标准品、HSV
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2标准品、EBV标准品、HCMV标准品、阴性对照品、HSV
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1阳性对照品、HSV
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2阳性对照品、EBV阳性对照品、HCMV阳性对照品、说明书和盒体组成，可对样品中的四种人疱疹病毒同时进行分型检测，满足早期、快速、准确诊断的需要，为流行病学调查和及时制定针对性治疗方案提供有力依据。专利CN201710118846.9则公开了一种人疱疹病毒各亚型快速检测试剂，包括特异性扩增HSV
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1RL2，HSV
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2UL28，VZV ORF26，EBV EBNA1，HCMV IE，HHV
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6A或HHV
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6B U22，HHV
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6A或HHV
‑
6B IE，HHV
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7U95和KSHV ORF72的正反向引物和相应内参标品，可针对不同来源的感染早期临床样本进行快速、有效的各亚型鉴别与诊断，具有很高的临床诊断使用价值。
[0006]目前尚未确立血清学标志物与EBV病毒、HCMV病毒拷贝之间的关系，因此，亟需提供一种直接判断EBV、HCMV病毒病毒复制活跃程度，检测准确度、灵敏度高的引物探针组合物及其试剂盒。

技术实现思路

[0007]为了解决现有技术中的上述问题，本申请提供了一种同时检测EBV病毒和人巨细胞病毒HCMV的引物探针组合物及其应用。本专利技术所述的引物组合物互不发生干扰，具有较好的检测灵敏度和准确度，且操作简便，能够广泛应用于EBV病毒和人巨细胞病毒HCMV的临床诊断。
[0008]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0009]一方面，本专利技术提供了一种检测EBV和HCMV病毒的引物探针组合物，所述的引物探针组合物包括HCMV检测引物探针组合物、EBV检测引物探针组合物和内标检测引物探针组合物。
[0010]具体地，所述的HCMV病毒基因组约250kb，可编码多种蛋白质，但UL123编码的IE1和UL122编码的IE2是表达量最多且最重要的。IE1被认为是HCMV及宿主细胞基因表达的反式激活因子，也是病毒感染后最先合成的蛋白，对于低MOI感染时病毒基因的表达及复制不可或缺。IE2是HCMV溶解周期的主要活化因子，对病毒复制具有不可替代的作用。作为HCMV表达最丰富的蛋白，IE蛋白不仅在对抗宿主细胞的固有及特异性免疫方面有重要作用，还可通过多种机制影响病毒的潜伏及活化状态。因此针对其IE1基因，通过NCBI(美国国家生物信息中心)GeneBank数据库比对该基因的保守序列，设计引物探针序列，其靶序列为SEQ ID NO.1所示的序列。
[0011]具体地，所述的EB病毒基因组全长约172kb。其中Bam H1W片段长3072bp，高度保守，在基因组中重复12次，此重复序列的两侧分别为短的(us)和长的(uL)独特序列区。因此针对其Bam H1W基因，通过NCBI(美国国家生物信息中心)GeneBank数据库比对大量该基因的保守序列，设计了引物探针序列，其靶序列为SEQ ID NO.5所示的序列。
[0012]具体地，内标则采用人RNaseP基因片段，其靶序列为SEQ ID NO.9所示的序列。
[0013]进一步具体地，所述的引物组合物包括：
[0014](1)HCMV检测引物探针组合物：
[0015]正向引物HCMVF：5
’‑
TCAGCATGTGCTCCTTGATTCT
‑3’
(SEQ ID NO.2)
[0016]反向引物HCMVR：5
’‑
GTGTTGTTATCCTCCTCTACAGTCAAAC
‑3’
(SEQ ID NO.3)
[0017]探针HCMVP：5
’‑
TGCCGCACCATGTCCACTCGAA
‑3’
(SEQ ID NO.4)；
[0018](2)EBV检测引物探针组合物：
[0019]正向引物EBF：5
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测EBV和HCMV病毒的引物探针组合物，其特征在于：所述的引物探针组合物包括HCMV检测引物探针组合物、EBV检测引物探针组合物和内标检测引物探针组合物；(1)HCMV检测引物探针组合物：正向引物HCMVF：5
’‑
TCAGCATGTGCTCCTTGATTCT
‑3’
反向引物HCMVR：5
’‑
GTGTTGTTATCCTCCTCTACAGTCAAAC
‑3’
探针HCMVP：5
’‑
TGCCGCACCATGTCCACTCGAA
‑3’
；(2)EBV检测引物探针组合物：正向引物EBF：5
’‑
AAGTGGTCCTGCAGCTATTTCTG
‑3’
反向引物EBR：5
’‑
AGAAGACCCCCTCTTACATTTGTG
‑3’
探针EBP：5
’‑
CGCATCAGAGCGCCAGGAGTCC
‑3’
；(3)内标检测引物探针组合物：正向引物ICF：5
’‑
AGATTTGGACCTGCGAGCG
‑3’
反向引物ICR：5
’‑
GAGCGGCTGTCTCCACAAGT
‑3’
探针ICP：5
’‑
TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG
‑3’
。2.根据权利要求1所述的引物探针组合物，其特征在于：所述的HCMV检测引物探针组合物用于检测SEQ ID NO.1所示的序列，所述的EBV检测引物探针组合物用于检测SEQ ID NO.5所示的序列，所述的内标检测引物探针组合物用于检测SEQ ID NO.9所示的序列。3.根据权利要求2所述的引物探针组合物，其特征在于：所述的探针的5
’
端荧光标记选自FAM基团、VIC/HEX/JOE基团、ROX基团、CY5基团、CY3基团、TAMRA基团其中不同的三种；淬灭基团选自BHQ
‑

【专利技术属性】
技术研发人员：曹玉峰，郑冉，高青，
申请(专利权)人：山东见微生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：